Identification, characterization and pathophysiological role of circulating myeloid calcifying cells in diabetic vasculopathy

Vascular calcification is a hallmark feature of diabetic vasculopathy (Abedin M. et al., 2004; Johnson R.C. et al., 2006). Within atherosclerotic lesions, intimal microcalcifications contribute to destabilize the plaque (Virmani R. et al., 2006). The mechanisms increasing vascular calcification in diabetes are incompletely understood: excess concentrations of procalcific factors and reduction of osteogenic inhibitors may be involved (Johnson R.C. et al., 2006). Cells that initiate vascular calcification are yet to be definitely identified: vascular wall resident cells, such as smooth muscle cells or pericytes, can transdifferentiate and produce a mineralized matrix (Iyemere V.P. et al., 2006). In addition, Eghbali-Fatourechi et al described the existence of circulating osteoblastic cells in human peripheral blood that calcify in vitro and in vivo (Eghbali-Fatourechi G.Z. et al., 1966). These cells, which express the bone protein osteocalcin (OC) and bone alkaline phosphatase (BAP), have been considered circulating osteoprogenitor cells, but their origin is unclear. Classic osteoprogenitor cells in the bone marrow originate from the mesenchymal compartment, but one study proposed that OC+ and BAP+ cells might not be completely distinct from hematopoietic stem cells (Eghbali-Fatourechi G.Z. et al., 2007). Circulating OC+ and BAP+ cells have been found to increase after a fracture (Eghbali-Fatourechi G.Z. et al., 1966), possibly through stimulation of the bone marrow niche to release cells with an osteogenic phenotype (Kumagai K. et al, 2008; Otsuru S. et al., 2008). In relation to cardiovascular disease (CVD), preliminary clinical studies found that coronary atherosclerosis and arterial stiffening are associated with activation of an osteogenic program in bone marrow–derived cells (Gossl M. et al., 2008; Pirro M. et al., 2011), but the pathophysiological role of these cells in vascular calcification is still unknown. In this work we investigated the nature, origin, and activity of human circulating procalcific cells. We demonstrate for the first time that a distinct subpopulation of circulating cells expressing osteocalcin and bone alkaline phosphatase (OC+BAP+) has procalcific activity in vitro and in vivo. OC+ BAP+ cells originate from the myeloid lineage and mantain monocyte/macrophage markers, and a subpopulation of them is longlived. These “myeloid calcifying cells” (MCCs) can be differentiated from peripheral blood mononuclear cells and form ectopic calcifications in vivo. Moreover, generation of MCCs was closely associated with expression of the osteogenic transcription factor Runx2. In gender-mismatched bone marrow transplanted humans, circulating MCCs had a much longer half-life compared with OC-BAP- cells, suggesting they belong to a stable cell repertoire. From a clinical point of view, we provide evidence that MCCs are overrepresented in type 2 diabetes blood and atherosclerotic lesions, whereas glycemic control was able to reduce MCCs toward normal levels. The study of naϊve patients with chronic myeloid leukaemia indicated that OC+BAP+ cells have a myeloid origin. Furthermore, high glucose increased calcification by MCCs in vitro, and hypoxia may regulate MCC generation in vitro and in vivo. Taken together, these data identify a novel source of procalcific cells that may contribute to vascular calcification, which is involved in the high cardiovascular risk associated with diabetes

La calcificazione vascolare è una caratteristica tipica della vasculopatia diabetica (Abedin M. et al., 2004; Johnson R.C. et al., 2006). All’interno delle lesioni aterosclerotiche, le microcalcificazioni dell’intima, contribuiscono a destabilizzare la placca aterosclerotica (Virmani R. et al., 2006). I meccanismi che aumentano la calcificazione vascolare nel diabete sono ancora non completamente conosciuti: una eccessiva concentrazione di fattori procalcifici e una riduzione degli inibitori osteogenici potrebbero essere coinvolti in questo processo (Johnson R.C. et al., 2006). Le cellule che iniziano il processo di calcificazione vascolare non sono ancora state identificate definitivamente: cellule vascolari residenti nella parete dei vasi, come cellule muscolari lisce o periciti, potrebbero transdifferenziare e produrre matrice mineralizzata (Iyemere V.P. et al., 2006). Inoltre, Eghbali-Fatourechi et al hanno descritto l’esistenza di una popolazione di cellule osteoblastiche circolanti nel sangue periferico umano capaci di calcificare in vivo e in vitro (Eghbali-Fatourechi G.Z. et al., 1966). Queste cellule, che esprimono osteocalcina (OC) e fosfatasi alcalina ossea (BAP), sono state considerate cellule progenitrici circolanti, ma la loro origine non è ancora stata chiarita. Le cellule osteoprogenitrici classiche, quelle del midollo osseo, originano dal compartimento mesenchimale, ma uno studio recente ha proposto che le cellule OC+ e BAP+ non debbano essere completamente distinte dalle cellule staminali ematopoietiche (Eghbali-Fatourechi G.Z. et al., 2007). E’ stato trovato un aumento delle cellule circolanti OC+ BAP+ dopo una frattura (Eghbali-Fatourechi G.Z. et al., 1966). Questo potrebbe essere dovuto ad una stimolazione della nicchia del midollo osseo nel rilasciare cellule con un fenotipo osteogenico (Kumagai K. et al, 2008; Otsuru S. et al., 2008). In relazione alle malattie cardiovascolari (CVD), studi clinici preliminari hanno dimostrato che aterosclerosi coronarica e rigità arteriosa sono associate con l’attivazione di un programma osteogenico nelle cellule derivanti dal midolo osseo (Gossl M. et al., 2008; Pirro M. et al., 2011), ma il ruolo patofisiologico di queste cellule nella calcificazione vascolare non è ancora chiaro. In questo lavoro abbiamo cercato di determinare la natura, l’origine e l’attività delle cellule procalcifiche circolanti umane. Abbiamo dimostrato per la prima volta che esiste una sottopopolazione di cellule circolanti che esprimono fosfatasi alcalina ossea e osteocalcina (OC+BAP+) e che possiede attività procalcifica in vivo e in vitro. Le cellule OC+ BAP+ sono di origine mieloide e mantengono i marker tipici dei monociti e dei macrofagi, inoltre una sottopopolazione di queste sono longeve. Queste cellule calcifiche mieloidi (myeloid calcifying cells, MCCs) possono differenziare dalle cellule mononucleate del sangue periferico e formare calcificazione ectopica in vivo. Inoltre la formazione di MCC è stata associata strettamente con l’espressione di Runx2, che è un fattore di trascrizione osteogenico. Nel trapianto di midollo osseo umano gender-mismatched le cellule circolanti MCC hanno un’emivita maggiore rispetto alle cellule OC-BAP-, suggerendo che queste cellule appartengano ad un repertorio cellulare stabile. Da un punto di vista clinico, abbiamo dimostrato che le MCC sono sovraespresse nel sangue dei pazienti con diabete di tipo 2 e lesioni aterosclerotiche mentre un controllo glicemico è in grado di ridurre queste cellule portandole a livelli normali. Lo studio di pazienti naϊve con leucemia mieloide cronica indica che le cellule OC+BAP+ sono di origine mieloide. Inoltre, alte concentrazioni di glucosio aumentano la calcificazione in vitro, e condizioni di ipossia possono regolare la formazione di MCC in vivo e in vitro. Presi nel loro insieme questi dati identificano una nuova sorgente di cellule procalcifiche che possono contribuire alla calcificazione vascolare, la quale è coinvolta nell’alto rischio di malattia cardiovascolare associata al diabete