Non-genomic Mechanisms in the Regulation of Glycolytic Proteins by Estrogen Receptor Ligands in Cells with High Glycolytic Reliance

17β-estradiol (E2) affects multiple aspects of tissue and cell metabolism with implications in physiological and pathological conditions. Few studies have been conducted to explore the mechanisms coupling hormonal signals to metabolic demand in cells with high glycolytic reliance such as endothelial cells. We recently showed that E2 triggers angiogenesis via the membrane estrogen receptor GPER and the key glycolytic protein PFKFB3 as a downstream effector. In particular, we reported that E2 rapidly increases PFKFB3 protein levels in a concentration-dependent manner without affecting PFKFB3 mRNA levels, suggesting that non-genomic mechanisms drive estrogen-boosted glycolysis in the vascular endothelium. We investigated whether estrogenic agents contribute to rapid adaptation of metabolic demand in human umbilical cord vascular endothelial cells (HUVECs) by regulating glycolytic protein levels through non-genomic mechanisms involving protein stability and/or degradation. Similarly to E2, the GPER selective agonist G1 increased PFKFB3 protein amounts peaking at 3 h, without affecting mRNA levels. When protein synthesis was inhibited by cycloheximide, E2 treatment prevented PFKFB3 degradation over time. Similar results were obtained with G1. In addition, the selective E3 ubiquitin ligase (SMER-3) as well as the proteasome inhibitor MG132 rapidly increased PFKFB3 protein levels, thus mimicking the effect of estrogenic agents. Accordingly, the levels of ubiquitin-bound PFKFB3 decreased in HUVECs treated with either E2 or G1. Notably, both ER ligands increased the deubiquitinase USP19 levels whereas GPER siRNA counteracted this effect. Moreover, E2 and G1 treatment enhanced GLUT1 expression in a short time frame (1 h) through a mechanism unrelated to transcriptional activation. Differently from what observed for PFKFB3, we found that treatment with E2 did not affect GLUT1 stability, at least over 24 hours. Accordingly, HUVECs treatment with the proteasome inhibitor MG132 for 3-6 h did not change GLUT1 levels, suggesting that alternative post-transcriptional mechanisms are likely involved. MiRNAs may contribute to post-transcriptional regulation of protein abundance by binding to the 3’-UTR of target mRNAs, leading to translational repression. Based on the evidence that E2 downregulates the expression of miRNA-206 and miRNA-26, thereby increasing PFKFB3 levels and breast cancer cell proliferation and invasion, we hypothesized that estrogenic agents would regulate glycolytic proteins post-transcriptionally via shared miRNAs. To test the involvement of specific miRNA in PFKFB3 turnover, we set up a luciferase gene assay. For this purpose we first generated a vector containing the 3’-UTR region of human PFKFB3. Since we were unable to efficiently deliver the vector to HUVECs, we decided to use the ovarian cancer cell line SKOV3. We showed that treatment with E2 or G1 did not induce a proliferative response in SKOV3, and that the proliferation was not inhibited by the selective ERα and GPER antagonists MPP and G15, respectively. However, treatment with E2 as well as G1 induced SKOV3 migration in a concentration-dependent manner, suggesting that SKOV3 are responsive to estrogenic agents. E2 treatment increased PFKFB3 levels in SKOV3 at early time points and for up to 24 h, without affecting PFKFB3 mRNA levels, in line with what observed in HUVECs. Next, to explore the role of specific miRNAs in PFKFB3 turnover and the interplay with estrogenic agents, we transfected SKOV3 with the vector containing human PFKFB3-3’UTR with high transfection efficiency. Using the luciferase assay, we found that both miRNA-26b and miRNA-206 reduced luciferase activity with respect to miRNA-negative control. Consistently, miRNA-26b and miRNA-206 mimics significantly decreased PFKFB3 protein levels, and pretreatment with E2 did not revert the effect of the above miRNA mimics. Further studies are required to establish whether estrogenic agents up-regulate PFKFB3 by inhibiting endogenous miRNA expression/activity. In conclusion, we showed that the membrane receptor GPER mediated the post-transcriptional regulation of endothelial GLUT1 and PFKFB3 abundance. We add knowledge to the mechanisms coupling hormonal signals with metabolic demand in cells that rely on glycolysis to exert their functions, showing that estrogenic agents in endothelial cells enhanced the amount of a) GLUT1 protein but not mRNA, and b) PFKFB3 protein by increasing deubiquitinase USP19 levels, thereby reducing its ubiquitination and further degradation; in addition, c) E2 controlled PFKFB3 protein levels in SKOV3 cells via post-transcriptional mechanisms, likely involving miRNA regulation.Overall, these results might have implications in estrogen’s protective and prophylactic effects in vascular ischemic disorders where rapid metabolic and functional adaptation to environmental changes is required. In addition, the identification of E2-targeted miRNAs in cancer cells, which in turn regulate glycolytic protein levels and thus likely cell growth and invasiveness, will pave the way to the development of miRNA-based treatments for blocking adverse hormone functions such as pathological angiogenesis in E2-dependent cancers.

Il 17beta-estradiolo (E2) ha molti effetti sul metabolismo tissutale e cellulare con implicazioni fisiologiche e patologiche. Sono stati condotti pochi studi sui meccanismi che collegano i segnali ormonali alla domanda metabolica in cellule a metabolismo glicolitico, come le cellule endoteliali (CE). Abbiamo evidenziato che E2 innesca il processo angiogenetico attraverso il recettore di membrana GPER e la proteina glicolitica PFKFB3 come effettore a valle. In particolare, E2 aumenta rapidamente i livelli della proteina PFKFB3 senza influenzarne l’mRNA, suggerendo che nelle CE, E2 controlla la glicolisi attraverso meccanismi non-genomici. Lo scopo della tesi è stato quello di investigare se gli agenti estrogenici contribuiscano al rapido adattamento metabolico delle CE, regolando i livelli di proteine glicolitiche attraverso meccanismi non-genomici, implicati nella stabilità e/o nella degradazione proteica. Similmente a E2, l’agonista selettivo di GPER aumenta i livelli di proteina ma non di mRNA di PFKFB3. Quando la sintesi proteica viene inibita, il trattamento con E2 o G1 prevengono la degradazione di PFKFB3. Inoltre, l’inibitore selettivo di una E3 ligasi così come l’inibitore del proteasoma, aumentano i livelli di PFKFB3. In linea con questo risultato, abbiamo dimostrato che la quantità di ubiquitina legata a PFKFB3 è minore nelle CE trattate con E2 o con G1. Entrambi i ligandi aumentano i livelli di deubiquitinasi USP19 mentre il siRNA specifico di GPER contrasta questo effetto. Inoltre, il trattamento con E2 o con G1 aumenta l'espressione di GLUT1 attraverso un meccanismo non trascrizionale. Abbiamo anche osservato che il trattamento con E2 non influenza la stabilità di GLUT1, suggerendo il coinvolgimento di meccanismi diversi dalla degradazione. I miRNA contribuiscono alla regolazione post-trascrizionale delle proteine e la loro azione porta alla repressione della traslazione. Poiché nelle cellule di carcinoma mammario E2 aumenta i livelli di PFKFB3 riducendo l'espressione di miRNA-206 e -26, abbiamo ipotizzato che gli agenti estrogenici regolassero le proteine glicolitiche tramite miRNA condivisi. Abbiamo creato un vettore contenente la regione 3′-UTR di PFKFB3 legata alla luciferasi. Non essendo riusciti a trasfettare in modo efficiente il vettore nelle CE, abbiamo utilizzato le cellule SKOV3. Abbiamo osservato che il trattamento con gli agenti estrogenici non modifica la proliferazione delle SKOV3, ma induce la migrazione delle stesse. Inoltre, abbiamo dimostrato che E2 aumenta la proteina PFKFB3 ma non i livelli di mRNA. Per esplorare il ruolo di miRNA specifici nel turnover di PFKFB3 e l'interazione con agenti estrogenici, abbiamo trasfettato efficacemente le cellule SKOV3 con il vettore contenente PFKFB3-3'UTR. Abbiamo scoperto che i miRNA-26b e -206 riducono l'attività della luciferasi rispetto al controllo negativo. Coerentemente, la sovraespressione di miRNA-26b e miRNA-206 riducono significativamente i livelli di proteina PFKFB3; il pretrattamento con E2 non reverte l'effetto dei miRNA. In conclusione abbiamo dimostrato che il recettore di membrane GPER media la regolazione post-trascrizionale di GLUT1 e PFKFB3 nell’endotelio. Abbiamo rivelato nuovi meccanismi che associano i segnali ormonali alla domanda metabolica in cellule che si basano sulla glicolisi per esercitare le loro funzioni, dimostrando che gli agenti estrogenici nelle cellule endoteliali aumentano la quantità a) della proteina GLUT1 ma non del suo mRNA e b) della proteina PFKFB3 riducendone la sua degradazione attraverso un aumento dei livelli della deubiquitinasi USP19; inoltre, c) E2 controlla i livelli di proteina PFKFB3 nelle cellule SKOV3 attraverso meccanismi post-trascrizionali, probabilmente attraverso il coinvolgimento dei miRNA.