Identification of new subgroups and prognostic markers in pediatric B cell precursor acute lymphoblastic leukemia by gene expression profiling

Treatment of pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL) is increasingly successful, achieving cure rates of over 80%. Early identification of patients with high risk for relapse has led to improved outcome, however, two third of patients encountering relapse were initially stratified into low-intermediate risk groups. The identification of better upfront prognostic factors remains an important challenge in childhood ALL. In this thesis, gene expression profiling (GEP) was applied to different research approaches aiming to dissect subgroups and to find novel therapeutic targets in B cell precursor ALL (BCP ALL). Among BCP ALL, the patients lacking major genomic aberrations (B-others) represent the subgroup that is most in need of in depth investigations in order to indentify new prognostic factors and improve of risk stratification. To advance biological knowledge of B-others we performed an integrated study of gene and non coding RNAs expression and genetic aberrancies. Chapter 1 reports a study on profiling by gene expression arrays of 145 Italian B-others BCP ALL patients and in a representative subcohort of patients microRNAs (miRNAs) expression profiling and genome-wide DNA copy number variation analysis. In this study we found that 25% of Italian B-others patients fits in a group with unique signature and is associated to a favourable outcome. MicroRNAs expression profiling of this group revealed an unique miRNAs signature characterized by over expression of hsa-miR-125b, -125b-2*, -99a, -100, -125a-3p and has-miR-491-5p. Over expression of cluster miR-125b-2 in region 21q21.1 goes along with over expression of genes in the same chromosomal region. Genome-wide analysis excluded copy number alteration of the 21q21.1 region. The frequent involvement of human chromosome 21 (Hsa21) aberrations in ALL (e.g. hyperdiploidy (HD), t(12;21) or iAmp21) and the involvement of the 21q21.1 region suggest a direct and functional contribution of Hsa21 genes to the malignant transformation of hematopoietic cells. There for there is high interest in studying ALL in children with Down Syndrome (DS), where trisomy 21 is constitutional and where the incidence of ALL is approximately 20-fold higher than in the general population. In Chapter 2 is presented a study of genomic analysis of a large group of DS ALLs that characterizes molecular abnormalities specific of this ALL group. Gene expression analysis revealed that DS ALL is a highly heterogeneous disease not definable as a unique ALL subtype with an enrichment of DNA damage and BCL6 responsive genes suggesting B-cell lymphocytic genomic instability. Surprisingly, only a single Hsa21 gene, SON was included in the DS ALL signature and it was only slightly upregulated. Furthermore gene expression data suggested that DS ALL and HD ALL are very different leukemias, reflecting the fundamental differences between constitutional and acquired trisomy such as the developmental stage in which the trisomy occurs and the fact that a constitutional trisomy is present both in the leukemia cells and in their microenvironment. The study further revealed that 62% of the DS ALL samples were characterized by aberrant expression of the type I cytokine receptor CRLF2. Two kind of aberrations involving CRLF2 were identified: a cryptic translocation involving IGH@ and CRLF2 in the pseudoautosomal region (PAR1) of the sex chromosomes and a deletion within PAR1. This aberration resulted in the P2RY8-CRLF2 fusion and leads to overexpression of CRLF2. Furthermore a novel activating somatic mutation, F232C, in CRLF2 was identified. We demonstrated that CRLF2 and mutated JAK2 cooperate in conferring cytokine independent growth to pro-B cells suggesting that the DS ALL children with CRLF2 aberrant expression may benefit from therapy blocking the CRLF2-JAK2 pathway. Since CRLF2 aberrations were found also among non DS patients, we further analyzed the incidence and prognostic impact of this potential new marker in BCP ALL Italian patients enrolled into the AIEOP-BFM ALL2000 study. Chapter 3, presents the study of a representative cohort of 464 non DS BCP ALL patients that was analyzed for the expression levels of CRLF2 and for the occurrence of CRLF2 rearrangements. In this study we found that the P2RY8-CRLF2 rearrangements in association with 20 times over expression of CRLF2 identifies BCP ALL patients with a very poor prognosis and, among them, an important subset of patients currently stratified in the intermediate risk need to be considered for treatment adaptation. Investigating the pathways highlighted by GEP analysis and testing drug effects require a substantial availability of leukemia samples. Primary ALL samples are difficult to culture in vitro and currently available cell lines poorly reflect the heterogeneous nature of the disease. Mouse xenotransplantation models are therefore widely used for in vivo testing and to amplify the number of leukemia cells to be used for various analyses. In Chapter 4 study we assessed the capability of xenografted samples to recapitulate their respective primary leukemia, and we investigated whether the murine microenvironment selects for leukemia initiating cells leading to a bulk tumor markedly different from the diagnostic patient sample. We analysed the gene expression profiles of 7 primary paediatric ALL samples at diagnosis as well as of their respective xenograft leukaemia samples after serial primary, secondary and tertiary passages in the NOD/SCID/huALL transplant model. In this study we demonstrated that the NOD/SCID/huALL transplant model recapitulates the primary human leukaemia, mimics the features of the primary malignancy and retains these characteristics over serial passages without selection for a subclone of the initial leukaemia. Chapter 5 reports on a study that investigated engraftment properties of 50 pediatric ALL samples transplanted into NOD/SCID mice. Time to leukemia (TTL) was determined for each patient sample engrafted as weeks from transplant to overt leukemia. The study shows that short TTL was strongly associated with high risk for early relapse, identifying a new independent prognostic factor. The high risk phenotype is reflected by a gene signature that identified patients with early relapse in an independent patient cohort. Gene expression profiling revealed a set of genes associated with this aggressive phenotype providing a potential strategy to identify these high-risk patients. Most importantly, pathways involving mTOR regulating cell growth were identified, providing targets for alternative therapeutic strategies for these high risk patients. Concluding, ten years after its introduction in oncohematology, GEP constitutes to be a valuable research tool, efficacious in subtype discovery, biomarkers identification and discoveries of deregulated molecular pathways.

La cura della leucemia linfoblastica acuta (ALL) sta migliorando con successo, raggiungendo un tasso di guarigione che va oltre l’80%. L’identificazione precoce dei pazienti con alto rischio di ricaduta ha portato ad un miglioramento generale dell’outcome, tuttavia, due terzi dei pazienti che incorrono nell’evento di ricaduta vengono inizialmente stratificati in gruppi a basso rischio o rischio intermedio. L’identificazione di migliori fattori prognostici rimane un’importante sfida nelle ALL pediatriche. In questa tesi, lo studio del profilo di espressione genica è stato applicato a diversi approcci di ricerca, con lo scopo di individuare sottogruppi e trovare nuovi target terapeutici nelle ALL a cellule precursori B (BCP ALL) Tra le BCP ALL, i pazienti privi delle aberrazioni genomiche più riccorrenti (B-others) rappresentano il sottogruppo che più necessita di studi approfonditi, tesi ad identificare nuovi fattori prognostici e migliorare la loro stratificazione nelle classi di rischio. Per aumentare le conoscenze biologiche riferite al gruppo dei B-others, è stato eseguito uno studio integrato di espressione genica, espressione di non coding RNAs e analisi delle aberrazioni genetiche. Il Capitolo 1 riporta lo studio mediante microarrays di espressione genica di 145 pazienti Italiani affetti da BCP ALL e, in una sotto-coorte rappresentativa, lo studio dell’espressione dei microRNAs (miRNAs) e l’analisi di variazione di DNA copy number estesa all’intero genoma. Da questo studio è emerso che il 25% dei pazienti Italiani di tipo B-others rientrano in un gruppo con una signature specifica e sono associati ad un outcome favorevole. Lo studio del profilo di espressione dei miRNAs rivela in questo gruppo una specifica signature di miRNAs caratterizzata dalla sovra espressione di hsa-miR-125b, -125b-2*, -99a, -100, -125a-3p e has-miR-491-5p. La sovra espressione del cluster miR-125b-2 nella regione 21q21.1 è accompagnata dalla concomitante sovra espressione dei geni nella stessa regione cromosomica. Le analisi sul genoma hanno portato ad escludere la presenza di alterazioni di DNA copy number nella regione 21q21.1. Il frequente coinvolgimento di aberrazioni a carico del cromosoma 21 nelle ALL (come nel caso di iperdiploidia (HD), t(12;21) o iAmp21) e il coinvolgimento della regione 21q21.1, suggeriscono un diretto e funzionale contributo dei geni nel cromosoma 21 alla trasformazione maligna delle cellule ematopoietiche. A questo proposito c’è un grande interesse nello studio delle ALL nei bambini affetti dalla Sindrome di Down (DS), nei quali la trisomia 21 è costituzionale e per i quali l’incidenza di ALL è approssimativamente 20 volte maggiore che nel resto della popolazione. Nel Capitolo 2 viene presentato uno studio di analisi genomica di un grande gruppo di DS ALL che mira a caratterizzare le anomalie molecolari specifiche di questo gruppo di ALL. L’analisi di espressione genica ha rivelato che le DS ALL sono leucemie molto eterogenee, non definibili come un unico sottotipo di ALL, con un arricchimento di geni rispondenti al signalling di BCL6 e di risposta al danno al DNA, che suggerisce un’instabilità genomica dei linfociti B. Sorprendentemente, solamente un gene appartenente al cromosoma 21, SON, è compreso nella signature delle DS ALL e risulta solo debolmente up-regolato. Inoltre, i dati di espressione genica suggeriscono che le DS ALL e le HD ALL sono leucemie molto diverse, riflettendo le differenze fondamentali tra trisomia costituzionale e acquisita, quali lo stadio di sviluppo nel quale la leucemia insorge e il fatto che la trisomia costituzionale è presente sia nelle cellule leucemiche che nel microambiente. Lo studio ha inoltre rilevato che il 62% delle DS ALL sono caratterizzate da un’aberrante espressione del recettore per le citochine di tipo I CRLF2. Due tipi di aberrazioni che coinvolgono CRLF2 sono state identificate: una traslocazione criptica che coinvolge il locus IGH@ e CRLF2 nella regione pseudoautosomale PAR1 dei cromosomi sessuali e una delezione in PAR1. Queste aberrazioni danno luogo alla formazione del trascritto di fusione P2RY8-CRLF2 che determina la sovra espressione di CRLF2. Inoltre una nuova mutazione somatica attivante, F232C, in CRLF2 è stata identificata. E’ stato dimostrato che CRLF2 e JAK2 mutato cooperano nel conferire capacità di crescita indipendente da citochine a cellule pro-B suggerendo che i bambini affetti da DS e ALL con un’espressione aberrante di CRLF2 possono trarre beneficio da terapie mirate a bloccare il pathway di CRLF2-JAK. Dal momento che le aberrazioni a carico di CRLF2 sono state trovate anche tra i pazienti non affetti dalla Sindrome di Down, è stata analizzata l’incidenza e l’impatto prognostico di questo potenziale nuovo marcatore nei pazienti Italiani con BCP ALL arruolati nello studio AIEOP-BFM ALL2000. Il Capitolo 3 presenta lo studio di una coorte rappresentativa di 464 pazienti con BCP ALL non affetti da DS che è stata analizzata per l’espressione di CRLF2 e per la presenza di riarrangiamenti a carico di CRLF2. Da questo studio è emerso che il riarrangiamento P2RY8-CRLF2 in associazione con la sovra espressione di CRLF2 (di almeno 20 volte maggiore che nel resto della coorte), identifica pazienti con una prognosi molto sfavorevole e, tra essi, un inportante sottogruppo di pazienti attualmente stratificati nella classe di rischio intermedia e che necessitano di essere considerati per un adeguamento della terapia. Per investigare i pathways emersi dalle analisi di espressione genica e per testare l’effetto dei farmaci è necessaria una grande disponibilità di cellule leucemiche. Le cellule da leucemia primaria sono difficili da coltivare in vitro e le linee cellulari attualmente disponibili non riescono a riflettere la natura eterogenea della malattia. Per questo motivo i modelli di xenotrapianto in topo sono ampiamente usati sia per lo studio in vivo che per amplificare il numero di cellule leucemiche da usare nelle varie analisi. Nello studio riportato nel Capitolo 4 è stata verificata la capacità delle cellule leucemiche ottenute da xenotrapianto di ricapitolare la loro rispettiva leucemia primaria ed è stata valutata la possibilità di una selezione da parte del microambiente murino per particolari cellule “inizianti” la leucemia che portino ad una massa tumorale marcatamente diversa da quella dei pazienti alla diagnosi. E’stato analizzato il profilo di espressione genica di 7 ALL primarie pediatriche alla diagnosi e le rispettive cellule leucemiche ottenute da xenotrapianto dopo un primo, un secondo ed un terzo passaggio seriale nel modello di trapianto di leucemia umana in topo NOD/SCID/huALL. In questo studio è stato dimostrato che il modello di trapianto NOD/SCID/huALL ricapitola la leucemia primaria umana, mima le caratteristiche del tumore primario e ne trattiene le caratteristiche durante i passaggi seriali senza selezionare per un sottoclone della leucemia primaria iniziale. Il Capitolo 5 riporta uno studio che ha investigato le proprietà di attecchimento di 50 ALL pediatriche trapiantate in topi NOD/SCID. Il tempo di attecchimento (Time To Leukemia – TTL) è stato determinato per ogni campione attecchito in termini di settimane trascorse dal trapianto alla manifestazione della leucemia. Lo studio ha mostrato che un breve TTL è fortemente associato con un alto rischio di ricaduta precoce, costituendo di fatto un nuovo marcatore prognostico indipendente. Il fenotipo di alto rischio è riflesso in una signature in grado di identificare pazienti incorsi precocemente nell’evento di ricaduta in una coorte di pazienti indipendente. Lo studio di espressione genica rivela una serie di geni associati con questo fenotipo aggressivo, mettendo a diposizione una potenziale strategia per identificare i pazienti ad alto rischio. In modo ancora più importante, pathways che regolano la crescita cellulare e che coinvolgono mTOR sono stati identificati, indicando dei target per strategie terapeutiche alternative per i pazienti ad alto rischio di riaduta. Concludendo, dieci anni dopo la sua introduzione in oncoematologia, lo studio del profilo di espressione genica si conferma essere un valido strumento di ricerca, efficace nella scoperta di nuovi sottotipi, nell’individuazione di biomarcatori e nel portare alla luce pathways molecolari deregolati.