Il sistema dell'ossido nitrico come mediatore della biogenesi mitocondriale e della sensibilità insulinica

Background and aim: It has been hypothesized the existence of an impairment in mitochondrial function among the several effects that may be implicated in the pathogenesis of obesity, insulin resistance and their progression towards type 2 diabetes. Furthermore, insulin resistance is associated with a reduction in mitochondrial content and eNOS enzymatic activity. Physical exercise has been shown to induce important physiological adaptations, involving not only skeletal and cardiac muscle, but also vascular and metabolic systems. Two major events induced by physical activity are the induction of eNOS gene expression and the increase of tissue nitric oxide production, which in turn could influence mitochondrial biogenesis and glucose uptake. All these aspects suggest to further study the mechanisms involved in physical exercise-inducing mitochondrial biogenesis and nitric oxide production in order to better understand the cellular signalling and the gene expression regulation. I studied the effects of chronic aerobic exercise in different tissues obtained from eNOS-/- mice in terms of evaluation of biochemical parameters, mitochondrial biogenesis and capability of glucose uptake and I studied the effects of the treatment with a nitric oxide donor (DETA-NONOate) on HL-1 and 3T3-L1 cells in terms of mitochondrial biogenesis and glucose uptake. Materials and Methods: I performed a biochemical analysis, an expression analysis of genes involved in mitochondrial biogenesis, a mtDNA quantification and an analisys of the capability of glucose uptake in different tissues obtained from eNOS-/- and wild type mice after a 6 weeks period of exercise training. I set up a protocol for an in vitro treatment with a nitric oxide donor (DETA-NONOate 100µM for 72 hours) of HL-1 cardiomyocites and 3T3-L1 adipocytes and then I performed a gene expression analysis, a measurement of the capability of basal and insulin stimulated glucose uptake, an immunofluorescence analysis of mitochondrial biogenesis and a quantification of GLUT4 translocation after insulin stimulation. Results and conclusions: I observed an increase in gene expression, mtDNA content and capability of both basal and insulin-stimulated glucose uptake in different tissues obtained from wild type but not eNOS-/- mice after the exercise training protocol. In cells treated with DETA-NONOate I observed an increase in gene expression, mitochondrial biogenesis, capability of basal and insulin- stimulated glucose uptake and GLUT4 translocation compared to those without treatment. These results suggest that nitric oxide is a key molecule in the regulation of energy balance and glucose metabolism, and it may be involved in the activation of mitochondrial function and biogenesis. Further studies are needed to better clarify the role of NO and mitochondrial biogenesis in the pathogenesis of cardiovascular abnormalities linked with obesity and type 2 diabetes.

Stato dell'arte e scopo della tesi: Tra i differenti meccanismi implicati nella patogenesi dell'obesità , della resistenza insulinica e della loro progressione verso il diabete di tipo 2 è stata ipotizzata l'esistenza di un danno della funzione mitocondriale. Inoltre l'insulino resistenza è associata ad un ridotto contenuto mitocondriale e ad una riduzione dell'attività  dell'enzima eNOS che si presume essere il primo fattore implicato nella catena di signalling. Partendo dal presupposto che l'esercizio fisico aumenta la sensibilità  insulinica e la produzione di ossido nitrico, e che l'ossido nitrico è in grado di stimolare la biogenesi mitocondriale si è voluto analizzare se l'aumento della sensibilità  insulinica e della mitocondriogenesi mediato dall'esercizio fisico fosse correlato al metabolismo dell'ossido nitrico. Durante il mio dottorato di ricerca mi sono occupata dello studio degli effetti dell'esercizio fisico in alcuni tessuti di topi eNOS-/- in seguito a un protocollo di allenamento cronico di tipo aerobico. Ho studiato questi effetti in termini di dosaggi plasmatici, espressione genica e aumento del DNA mitocondriale e capacità  di captazione del glucosio in tessuto cardiaco, muscolare e adiposo. Mi sono inoltre occupata della valutazione degli effetti della somministrazione di ossido nitrico su cellule in coltura, cardiomiociti HL1 e adipociti 3T3-L1. Materiali e Metodi: Ho eseguito analisi biochimche mediante saggi enzimatici e misurazioni di parametri endocrino-metabolici, analisi di espressione genica, quantificazione di mtDNA e della capacità  di captazione di glucosio in diversi tessuti ottenuti da topi eNOS-/- e wild type dopo un periodo di 6 settimane di allenamento. Ho allestito un protocollo per il trattamento in vitro con un donatore di ossido nitrico (DETA-NONOato 100µM per 72 ore) su cellule HL-1 e 3T3-L1 e in seguito ho valutato l'espressione genica, la capacità  di captazione del glucosio sia in condizioni basali che insulino stimolate, l'analisi in immunofluorescenza della biogenesi mitocondriale e la traslocazione del trasportatore GLUT4 di queste cellule. Risultati e conclusioni: Ho osservato un aumento dell'espressione genica, del contenuto di mtDNA e della capacità  di captazione del glucosio in diversi tessuti dei topi wild type ma non di quelli eNOS-/- in seguito al periodo di allenamento. Nelle cellule trattate con DETA-NONOato ho osservato un aumento dell'espressione genica, della biogenesi mitocondriale, della capacità di captazione di glucosio sia basale che insulino-stimolata e della traslocazione di GLUT4 rispetto alle cellule di controllo che non erano state sottoposte al trattamento. Questi risultati suggeriscono che l'ossido nitrico abbia un ruolo chiave nella regolazione del bilancio energetico e del metabolismo del glucosio e confermano un suo coinvolgimento nell'attivazione della biogenesi mitocondriale. Saranno necessari ulteriori studi per indagare ulteriormente il suo ruolo nella patogenesi di complicanze cardiovascolari legate all'obesità  e al diabete di tipo 2.