Breeding new varieties of horticultural species by means of conventional genetics and biotechnological methods

The growing demand for new vegetable varieties is forcing seed companies to plan faster and more efficient breeding programs. Therefore, conventional breeding methods are increasingly supported by biotechnological methods. In particular, marker-assisted breeding (MAB) reduces the time needed to develop new varieties thanks to the use of molecular assays. The crucial role played by molecular markers in breeding new varieties is discussed in the three works carried out in different horticultural species belonging to Asteraceae family. In a first case study, conventional breeding methods are complemented by molecular methods throughout a typical breeding program in lettuce (Lactuca sativa L.). A total of 16 SSR (Simple Sequence Repeats) markers or microsatellites were efficiently used to genetically characterise 71 putative parental lines and to plan 89 crossings, designed to maximise the yield deriving from each manual pollination. After that, the resulting 871 progeny plants were screened, and their molecular profiles were compared with those expected considering their putative parents. The out-pollination success rate resulted in being, on average, 68 ± 33 % and 602 F1 hybrids were identified. Finally, in an advanced step of this breeding program, 47 different experimental populations (F3 generation) were evaluated in terms of observed homozygosity and genetic similarity within the population. Three of them resulted particularly suitable for pre-commercial trials due to observed median homozygosity above 90 % and an intra-genetic similarity value always higher than 95%. Hence, this study shows the synergetic effect of conventional and biotechnological methods in different steps of a breeding program. In addition to lettuce, different Cichorium intybus var. foliosum L. varieties were compared and molecularly characterised, both for the economic value and the great cultural interest of this species in Veneto region. C. intybus var. foliosum, better known in Italy as radicchio, is an important locally cultivated leafy vegetable that prevalently reproduces by allogamy. Considering that marker-assisted breeding is widely used by seed firms to develop new F1 hybrid varieties that are distinguished by high plant uniformity and crop yields, in this second case study we performed the molecular characterisation and the genetic structure investigation of different commercial populations of Radicchio. A total of 29 mapped microsatellite markers were used for genotyping 504 samples of the Red of Chioggia biotype. Two synthetics, four F1 hybrids and two derived F2 populations were initially characterised and compared in terms of genetic similarity and diversity statistics. Then, the uniformity and the stability of three years of production of an F1 variety were investigated by applying the same panel of molecular markers. As main finding, the mean similarity estimates enabled the clear molecular discrimination of OP synthetics from F1 varieties and their F2 progenies and the determination of individual plant memberships. Moreover, the genetic structure of F1 hybrids produced in 3 years unexpectedly revealed two main clusters that discriminate the first 2 years from the 3rd, mainly because of the presence of uncommon specific alleles and different allele frequencies. Overall, this molecular information will enable breeders to determine the genetic distinctness, uniformity and stability of commercial and experimental populations, as well as their genetic relationships and relatedness. Unlike the previous two more relevant and more studied species (lettuce and chicory), the amount of biological and molecular data available for endive (Cichorium endivia Lam.) is incredibly scarce. This species is a self-pollinated leafy green vegetable, belonging to the Asteraceae family and it is characterized by two cultivar types: curly endive (C. endivia var. crispum Lam.) and escarole or smooth endive (C. endivia var. latifolium Lam.). For seed firms the genetic diversity characterisation of elite breeding material is crucial for the registration and protection of future varieties. In our case study, we verified the distinctiveness of 32 experimental materials belonging to the two cultivar types (escarole and curly endive). In a first SSR-based attempt, only 14 out of 29 microsatellite markers belonging to C. intybus, were successfully transferred to endive and only 8 of them resulted polymorphic. Due to the limited level of discrimination of this molecular assay, an alternative approach based on single nucleotide polymorphisms (SNP) was applied using the restriction site-associated DNA sequencing (RADseq). Overall, a set of 4,621 SNP markers was able to separate curly endive from escarole endive and, in particular 50 of them were able to discriminate the two cultivar types. Moreover, the resulting SNP-supported dendrogram and the PCoA analysis divided the two cultivar types of endive into two distinct clusters, discriminating univocally all the plant materials. Overall, our research was able to evaluate the distinctiveness requirement of the DUS testing. We also evaluated the observed homozygosity to predict the uniformity and stability of progenies, two additional requirements of the DUS testing: individuals with the highest homozygosity are known to produce more uniform and stable populations over generations. In conclusion, this molecular information enabled breeders to determine the genetic distinctness of the 32 elite breeding materials and to reconstruct their genetic relationships.

La crescente domanda di nuove varietà sta spingendo le ditte sementiere a pianificare programmi di miglioramento genetico sempre più rapidi ed efficienti. Pertanto, i metodi convenzionali di costituzione di nuove varietà sono sempre più supportati da quelli biotecnologici. In particolare, la costituzione di nuove varietà assistita da marcatori (marker assisted breeding, MAB) riduce il tempo necessario per sviluppare nuove varietà grazie all’utilizzo di saggi molecolari. Nei seguenti tre lavori è discusso il ruolo cruciale svolto dai marcatori molecolari in questi programmi di miglioramento genetico, che sono stati condotti in diverse specie orticole appartenenti alla famiglia delle Asteraceae. Nel primo caso studio, i metodi convenzionali sono integrati dai metodi molecolari attraverso un tipico schema di miglioramento genetico in lattuga (Lactuca sativa L.). Sono stati impiegati marcatori SSR (Simple Sequence Repeats) o microsatelliti, 16 loci in totale, al fine di caratterizzare geneticamente 71 putative linee parentali e di pianificare 89 incroci, i quali sono stati progettati per massimizzare la resa delle impollinazioni manuali e il potenziale di ricombinazione genetica. Successivamente, la progenie risultante, costituita da 871 piante, è stata selezionata e i profili molecolari dei campioni sono stati confrontati con quelli dei loro putativi parentali. Il tasso di successo di questi incroci è risultato in media pari a 68 ± 33 % e il numero di ibridi F1 è risultato pari a 602. Infine, in una fase avanzata di questo programma genetico, sono state valutate 47 popolazioni sperimentali (generazione F3) in termini di omozigosi osservata e di similarità genetica. Tre di queste popolazioni sono risultate particolarmente idonee per accedere ai test pre-commerciali. In particolare questo materiale sperimentale presentava un elevato grado di omozigosi, superiore al 90 %, e gradi di similarità intra-popolazione superiori al 95 %. In conclusione, questo studio evidenzia l’effetto sinergico dei metodi convenzionali e biotecnologici in diverse fasi di un programma di miglioramento genetico. Oltre alla lattuga, sono state confrontate e caratterizzate molecolarmente diverse varietà di Cichorium intybus var. foliosum L., sia per il loro valore economico che per il grande interesse culturale di questa specie in Veneto. C. intybus var. foliosum, meglio conosciuto in Italia come radicchio, è un importante ortaggio a foglia coltivato localmente che si riproduce prevalentemente per allogamia. Le aziende sementiere si avvalgono ampiamente di marcatori molecolari per la costituzione di nuove varietà, soprattutto di ibridi F1 che si distinguono per la loro elevata uniformità e le rese colturali. In questo secondo caso studio abbiamo eseguito una caratterizzazione e un’indagine molecolare sulla struttura genetica di diverse popolazioni commerciali di Radicchio. Sono stati impiegati 29 marcatori microsatellite per la genotipizzazione di 504 campioni del biotipo rosso di Chioggia. In particolare, sono state inizialmente caratterizzate e confrontate in termini di similarità genetica, ricorrendo anche all’uso di statistiche sulla diversità genetica: due sintetiche, quattro ibridi F1 e due popolazioni F2 derivate. Utilizzando il medesimo saggio molecolare sono state valutate anche l’uniformità e la stabilità di tre lotti di tre anni di produzione di una varietà F1. I gradi medi di similarità risultanti hanno consentito la chiara discriminazione molecolare delle sintetiche OP dalle varietà F1 e dalla loro progenie F2, oltre che la determinazione delle singole popolazioni. Inoltre, la struttura genetica degli ibridi F1 prodotti in 3 anni ha rivelato inaspettatamente due gruppi principali che discriminano i primi due anni dal terzo, principalmente a causa della presenza di alleli specifici non comuni e di diverse frequenze alleliche. Nel complesso, queste informazioni molecolari consentiranno ai costitutori di determinare la distinzione genetica, l'uniformità e la stabilità di popolazioni commerciali e sperimentali, nonché le loro relazioni genetiche. A differenza delle due precedenti specie più rilevanti e più studiate (lattuga e cicoria), la quantità di dati biologici e molecolari disponibili per l’indivia (Cichorium endivia Lam.) è incredibilmente minore. Questa specie è un’orticola a foglia verde con un sistema riproduttivo di tipo autogamo. L’indivia appartenente alla famiglia delle Asteraceae ed è caratterizzata da due tipi di cultivar: indivia riccia (C. endivia var. crispum Lam.) e indivia scarola o liscia (C. endivia var. latifolium Lam.). Per le ditte sementiere la caratterizzazione genetica del loro materiale è fondamentale sia al momento della registrazione che in seguito per la protezione delle loro varietà. Nel nostro caso di studio, abbiamo verificato il carattere distintivo di 32 materiali sperimentali appartenenti ai due tipi di cultivar (indivia scarola e riccia). In un primo tentativo basato su marcatori SSR, solo 14 loci marcatori su 29 appartenenti a C. intybus sono stati trasferiti con successo in indivia e solo 8 di essi sono risultati polimorfici. A causa del livello limitato di discriminazione di questo saggio molecolare, è stato applicato un approccio alternativo basato su marcatori SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) utilizzando il sequenziamento del DNA associato al sito di restrizione (RADseq). Complessivamente 4.621 marcatori SNP sono stati in grado di separare tutti gli individui di indivia riccia e scarola, in particolare, 50 di loro hanno discriminato i due tipi di cultivar. Inoltre, il dendrogramma e l’analisi PCoA, supportati dagli SNP, hanno diviso i due tipi cultivar di indivia in due sottogruppi distinti, discriminando in modo univoco tutti i materiali vegetali. Nel complesso, la nostra ricerca è stata in grado di valutare la distinguibilità di tutti i campioni analizzati, che rappresenta il primo requisito del test DUS. É stato valutato, inoltre, anche il grado di omozigosi, in modo da prevedere l'uniformità della progenie, ovvero il secondo requisito del DUS test, in quanto gli individui con un elevato grado di omozigosi sono noti per produrre popolazioni maggiormente uniformi. In conclusione, queste informazioni molecolari hanno permesso i costitutori di determinare la distinguibilità genetica dei 32 materiali d’élite e ogni possibile loro relazione genetica.