Fabrication and characterization of spiral phase masks for super-resolution

Confocal microscopy, with both high lateral and axial resolution, has enabled the observation of the inner workings of cells and tissues with great detail. Strong scattering and absorption of light, though, strongly limit the depth at which samples can be imaged, and resolution is limited to a wavelength-wide area in the focal plane by diffraction. Sample penetration of hundreds of µm can be reached by nonlinear microscopy, based on the interaction between the tissue and multiple infrared photons, that undergo much less scattering and absorption. Resolutions of just tens of nanometers can also be reached with STED microscopy, an upgrade to the confocal architecture. Two-photon excitation STED (TPE-STED) microscopes have been invented in the last decade to combine the two properties, with resolution gains up to 4-5 times the diffraction-limited systems, at depths of tens of microns. Still, scattering and absorption of the depletion beam limit the observation of super-resolved features in the 100 µm regions. The aim of this thesis was the development of the first TPE-STED microscope working with excitation wavelengths in the [1000−1500] nm range and depletion wavelengths near 800 nm, capable of surpassing the depth limit of current STED microscopes. Suitable fluorophores must be used in this regime, so we tested the depletion performance of ATTO 594, ATTO 647N and mGarnet2. In parallel, we used the dual-beam nature of the platform to provide simultaneous nonlinear imaging with both degenerate and nondegenerate absorption of photons at the different wavelengths. A consistent part of the thesis work was also centered on the development of a protocol of fabrication and characterization optical elements for the manipulation of the STED beam. This was done in order to be able to freely couple every selected fluorophore with its most efficient depletion wavelength, without the need for long waiting times of commercial applications.

La microscopia confocale, con la sua alta risoluzione laterale e assiale, ha permesso l'osservazione delle dinamiche interne delle cellule e dei tessuti in modo dettagliato. La profondità alla quale è possibile osservare i campioni, però, è fortemente limitata dalla diffusione e dall'assorbimento subiti dalla luce, inoltre la risoluzione sul piano focale è limitata ad un'area di grandezza paragonabile alla lunghezza d'onda utilizzata, a causa della diffrazione. È possibile raggiungere profondità di centinaia di µm usando la microscopia nonlineare, basata sull'interazione tra il tessuto e più fotoni infrarossi, che subiscono molto di meno gli effetti della diffusione e dell'assorbimento nel tessuto. Risoluzioni di poche decine di nanometri possono inoltre essere ottenute grazie alla microscopia STED, un miglioramento della modalità confocale. Nell'ultimo decennio, sono stati sviluppati microscopi STED con eccitazione a due fotoni (TPE-STED), in modo da combinare queste due proprietà, con risoluzioni che a profondità di decine di micron arrivano fino a valori 4-5 volte migliori dei sistemi limitati dalla diffrazione. Ciononostante, la diffusione e l'assorbimento del fascio di deplezione limitano la profondità alla quale poter ancora osservare dettagli super-risolti a non più di un centinaio di micron. Lo scopo di questa tesi è stato lo sviluppo del primo microscopio TPE-STED con eccitazione nel range [1000-1500] nm e lunghezze d'onda di deplezione vicine agli 800 nm, in modo da poter sorpassare il limite di profondità degli attuali microscopi STED. In questo regime, sono necessari fluorofori adatti, e per questo abbiamo testato la performance delle molecole ATTO 594, ATTO 647N e mGarnet2. In parallelo, abbiamo usato il sistema a due fasci della piattaforma per fornire simultaneamente imaging nonlineare con assorbimento degenere e nondegenere di fotoni a diverse lunghezze d'onda. Una parte consistente del lavoro di tesi è stato anche concentrato sullo sviluppo di un protocollo di fabbricazione e caratterizzazione di elementi ottici per la manipolazione del fascio STED. Lo sforzo è stato compiuto con l'intenzione di poter abbinare liberamente ogni fluoroforo selezionato con la lunghezza di deplezione più efficiente, senza dover attendere i lunghi tempi necessari per la richiesta di soluzioni commerciali.