Towards the identification of small molecules inhibiting he dimerization of HCMV DNA polymerase processivity factor UL44

Human cytomegalovirus (HCMV) is a leading cause of congenital defects in humans. Currently available antivirals utilized for the therapy against HCMV infections have a series of contraindications due to their high cost, low bioavailability, high toxicity and the uprising of resistant viral strains. Furthermore no vaccine is available and no drugs are approved to prevent vertical transmission during pregnancy, therefore new, effective antiviral are highly needed. HCMV DNA polymerase accessory protein UL44 plays an essential role in viral replication, conferring processivity to the DNA polymerase catalytic subunit UL54 by tethering it to the DNA. Binding of UL44 to dsDNA occurs in the absence of ATP and clamp loaders, and depends on UL44 homodimerization. Indeed, our research group recently demonstrated that the protein can dimerize in cells and point mutations disrupting protein self-interaction also prevent DNA binding and abolish viral oriLyt-dependent DNA replication in transient transcomplementation assays. Therefore, disruption of UL44 homodimerization represents an attractive target for the development of new anti-virals. Based on these observations, using the recently published crystal structure of UL44 homodimers our research group previously performed a virtual screening with the Glide software in combination with a library of 1.3 x 10^6 small molecules (SMs) to identify SMs potentially interfering with UL44 homodimerization. After three rounds of screening (HTVS: high-throughput virtual screening, SP: standard precision, XP: extra precision), followed by an in depth analysis of compounds chemical properties, 18 SMs were selected for further analysis. Selected compounds were obtained from a commercial supplier, to be tested in a variety of assays for their ability to inhibit UL44 homodimerization both in cells and in vitro, as well as on HCMV replication. To this end, we applied a number of in cells and in vitro assays to monitor the effect of the SMs on UL44 dimerization. In cells methods included Fluorescent Resonant Energy Transfer (FRET) and Bioluminescence Resonant Energy Transfer (BRET), while as GST pull-down assays was chosen as the in vitro method. FRET acceptor photobleaching was capable of detecting both UL44 homodimerization and UL44 binding to the catalytic subunit C-terminal domain (residues 1125-1242). Such interactions were sensitive to point mutations specifically impairing the two processes, highlighting the specificity of this technique. Therefore, we were able to confirm that UL44 forms dimers in cells. However, data acquisition and analysis proved quite time consuming and dependent on high fusion proteins expression levels. BRET assays allowed to quickly and precisely quantitatively monitor UL44 self-interaction and binding to UL54 in living cells, and through saturation experiments allowed to precisely calculate Bmax and B50 values, relative to homodimerization or binding to UL54 for a number of single amino acids substitution derivatives of UL44 impaired for dimerization, binding to UL54 or to dsDNA, as well as for nuclear targeting. These data allowed gaining insights relative to the formation of HMCV DNA polymerase holoenzyme, suggesting conformational changes within UL44 upon DNA binding in complex to UL54. Furthermore, calculation of Bmax and B50 values was used to establish three different cellular systems expressing ideal amount of UL44 for screening purposes, in that they generated a BRET ratio similar to half of the Bmax. These included a fully stable expression system, whereby both RLuc-UL44 and YFP-UL44 are stably expressed in HEKA derived cells, a stable/transient system whereby YFP-UL44 is stably expressed and RLuc-UL44 is transiently expressed, or a fully transient system whereby both fusion proteins are transiently expressed. Competition assays performed overexpressing increasing amounts of FLAG-tagged UL44 as a competitor revealed that no inhibition could be obtained for the fully stably expressing system. This result highlighted the difficulty in disrupting a pre-existing protein complex and suggested to focus our attention on transient systems. Keeping this in mind, a first small-scale screening was performed to study the impact of 18 SMs on UL44 dimerization by BRET using the stable/transient system. The 18 selected SMs were resuspended in DMSO and their toxicity was evaluated in cell culture, before being added at sub-toxic concentration to the YFP-UL44 cell line, six hours post-transfection with RLuc-UL44. Our analysis identified only compounds slightly inhibiting the BRET ratio relative to UL44 homodimerization. Based on these disappointing results, we revaluated the BRET assays setup, by decreasing the time of SM incubation before assaying their effect from 42 to 18h, by switching to a completely transient system, and by decreasing the amount of expressed proteins. The last modification required a change in the substrate used for generation of bioluminescent signal from RLuc-fusion proteins from CTZ to hCTZ. A new screening was performed, which resulted in very similar results to those obtained using the original setup. Furthermore when hit candidates were re-evaluated for their effect using a negative control, their effect on BRET ratio of UL44 proved unspecific. Additionally, BRET - similarly to FRET - failed to detect a specific effect on the UL54/UL44 interaction by a SM known to disrupt such interaction. Therefore we conclude that, with our current settings, BRET and FRET are not the ideal techniques to search for SM inhibitors of protein-protein interactions We then focused on in vitro methods, starting with a GST pull-down assay, which was performed using UL44 C-terminal domain (residues 1-290), either fused to GST of a 6His-tag. Our results indicated that GST pull-down was capable of detecting differences in binding between wild-type UL44 and a dimerization-impaired mutant, suggesting a possible application for the screening of SMs. GST pull-down is currently being implemented for this purpose, and preliminary data suggest that a number of tested SMs could impair UL44 dimerization. In summary, we have developed a number of assays to monitor UL44 dimerization. Whereas in cells RET based assays confirmed that UL44 form dimers in living cells, they proved suboptimal for screening proposes. On the other hand, in vitro methods such as GST pull-down might prove more sensitive and are currently being implemented for the identification of SMs inhibitors of UL44 dimerization

Cytomegalovirus (CMV) è un importante patogeno di interesse umano. Al momento gli antivirali disponibili ed utilizzati per la terapia contro l’infezione da CMV presentano una serie di controindicazioni dovute all’alto costo, bassa biodisponibilità, alta tossicità ed il presentarsi di ceppi virali resistenti. Inoltre non è disponibile un vaccine ed ancora non è ancora stato approvato l’uso di alcun farmaco per prevenire la trasmissione verticale durante la gravidanza. Per questi motivi, sono necessari nuovi ed efficaci farmaci antivirali. La proteina accessoria UL44 della DNA polimerasi di CMV, svolge un ruolo essenziale nella replicazione virale, conferendo processività alla subunità catalitica UL54 ancorando il complesso oloenzimatico al DNA. Il legame di UL44 al dsDNA avviene in assenza di ATP e dei clamp loaders, e dipende dalla omodimerizzazione di UL44. Infatti, il nostro gruppo di ricerca ha recentemente dimostrato che la proteina può dimerizzare in cellule e che mutazioni puntiformi in grado di inficiare tale dimerizzazione prevengono il legame con il DNA ed aboliscono la replicazione del DNA virale oriLyt-dipendente in saggi di transcomplementazione transiente. Perciò, la distruzione dell’omodimerizzazione UL44 rappresenta un potenziale allettante bersaglio per lo sviluppo di nuovi anti-virali. Partendo da queste osservazioni ed usando la struttura cristallografica recentemente pubblicata degli omodimeri UL44, il nostro gruppo di ricerca ha eseguito un virtual screening con il software Glide in combinazione con una libreria di 1.3 x 10^6 piccole molecole (SMs) per identificare SMs che potenzialmente potessero interferire con l’omodimerizzazione di UL44. Dopo tre rounds di screening (HTVS: high-throughput virtual screening, SP: standard precision, XP: extra precision), seguiti da un’analisi delle proprietà chimiche dei composti, sono state selezione 18 SM per ulteriori analisi. I composti selezionati sono stati acquistati presso un fornitore commerciale, per essere testati in diversi saggi per valutare le loro abilità di inibire l’omodimerizzazione di UL44, sia in cellule che in vitro. A questo scopo, abbiamo utilizzato diversi saggi in cellule e in vitro per monitorare l’effetto delle SMs sulla dimerizzazione di UL44. Nei saggi cellulari, le tecniche utilizzate includono Fluorescent Resonant Energy Transfer (FRET) e Bioluminescence Resonant Energy Transfer (BRET), mentre per saggi in vitro è stato utilizzato il saggio GST-pull down. I nostri dati indicano che la metodica FRET acceptor photobleaching è in grado di rilevare sia l’omodimerizzazione di UL44, sia il legame con il dominio C-terminale della subunità catalitica (residui 1125-1242). Queste interazioni sono sensibili all’introduzione di mutazioni puntiformi che alterano i due processi, evidenziando la specificità di questa tecnica. Siamo stati quindi in grado di confermare che UL44 forma dimeri in un contesto cellulare. Purtroppo, l’acquisizione dei dati e la loro analisi richiedono un lungo tempo e dipendono da alti livelli di espressione delle proteine di fusione. Per contro, il saggio BRET permette un rapido e preciso monitoraggio quantitativo dell’omodimerizzazione di UL44 e il legame con UL54 in cellule viventi. Inoltre, attraverso esperimenti di saturazione, che permettono di calcolare in modo preciso i valori di Bmax e B50 relative all’omodimerizzazione o al legame con UL54 per varianti di UL44 che contengono singole sostituzioni amminoacidiche che affliggono la dimerizzazione di UL44, il suo legame a UL54 o il DNA, nonché il trasporto al nucleo della proteina. I dati ottenuti possono aiutare a comprendere il processo di formazione dell’oloenzima della DNA polimerasi di CMV, suggerendo cambiamenti conformazionali nel complesso olenzimatico in seguito a legame con il DNA. Inoltre, il calcolo di Bmax e B50 è stato usato per sviluppare tre differenti sistemi cellulari esprimenti un’ideale quantità di UL44 da utilizzare come piattaforma per lo screening di SM, poiché sono in grado di generare valori di BRET ratio simili al 50% della Bmax .Questi includono un sistema di espressione completamente stabile, in cui sia RLuc-UL44 che YFP-UL44 sono stabilmente espresse in cellule derivate da HEK293 A, un sistema ibrido stabile/transiente, in cui YFP-UL44 è stabilmente espressa e RLuc-UL44 è espressa in transiente, o un sistema completamente transiente in cui entrambe le proteine sono espresse transientemente. Saggi di competizione eseguiti sovra-esprimendo quantità crescenti di UL44 fusa a un FLAG tag hanno evidenziato che nessun inibizione può essere ottenuta per il sistema completamente stabile, probabilmente per la difficoltà di distruggere un complesso proteico preformato piuttosto che prevenirne la formazione. Per questo motive ci siamo focalizzati su sistemi transienti di espressione piuttosto che sul sistema interamente stabile. Sulla base di questi dati, un primo screening su piccolo scala è stato eseguito per studiare l’effetto di 18 SMs sulla dimerizzazione di UL44 usando il sistema BRET stabile/transiente. Le 18 piccole molecole sono state risospese in DMSO e la loro tossicità è stata valutata in coltura cellulare, prima di essere aggiunte a concentrazioni subtossiche alla linea YFP-UL44, sei ore dopo la trasfezione per esprimere RLuc-UL44. La nostra analisi ha identificato solo composti che inibivano blandamente il BRET ratio relativo alla dimerizzazione di UL44. Per questo motivo abbiamo ri-valutato il set up del saggio BRET, diminuendo il tempo d’incubazione delle SM prima di testare i valori BRET da 42 a 18 ore, utilizzando un saggio completamente transiente e diminuendo la quantità di proteine espresse. Per quest’ultima è stato necessario cambiare il substrato utilizzato per generare il segnale bioluminescente da CTZ a hCTZ. È stato eseguito un nuovo screening, con risultati molto simili a quelli ottenuti utilizzando il setup originale. Inoltre, quando i candidati migliori sono stati rivalutati usando un controllo negativo, il loro effetto sul BRET ratio è risultato aspecifico. Ulteriormente, la BRET, come la FRET, non è riuscita a rilevare uno specifico effetto nell’interazione UL44/UL54 di una SM in grado di distruggere questa interazione. Possiamo quindi concludere che BRET e FRET non sono tecniche ideali per la ricerca di SM inibitrici dell’interazione tra le proteine. Ci siamo poi focalizzati su metodi in vitro, partendo dal saggio GST-pull down, il quale è stato effettato utilizzando il dominio C-terminale (residui 1-290) di UL44, fuso o con GST o con 6His-tag. I risultati ottenuti mostrano che la tecnica GST-pull down è in grado di rilevare differenze nel legame tra UL44 wild-type e i mutanti con mutazioni nel sito di dimerizzazione, suggerendo una possibile applicazione di GST-pull down per lo screening delle SMs. Questa tecnica è stata implementata per questo studio, e i dati preliminari suggeriscono che il numero di SMs testate potrebbe portare all’inibizione della dimerizzazione di UL44. In conclusione, abbiamo sviluppato diversi saggi per monitorare la dimerizzazione di UL44. I saggi cellulari basati su RET confermano che UL44 forma dimeri in cellule viventi, e dimostrano di essere subottimali per lo screening. D’altro canto, i metodi in vitro come GST-pull down dimostrerebbero un maggiore sensibilità e sono stati implementati per l’identificazione degli inibitori della dimerizzazione di UL44.