DNA, variations on the theme

Molecular biology's central dogma, laid down in 1950s, affirmed that genetic information flows from DNA to RNA to protein synthesis. For a long time, the first element of this logic scheme, DNA, was regarded as inactive molecule with the sole purpose to act as a repository of genetic code. Indeed, the molecular dialogue between DNA and proteins has been generally interpreted as an univocal relationship between an inert partner (nucleic acid) and a versatile one (proteins), that remodels DNA as a clay object. Rather, has been emerged that each kind of interactions between macromolecules requires a mutual structural adaptation and chemical complementarity. As in Kurosawa’s classic movie “Rashomon” (1950) the same central event, a heinous crime, is recalled from the differing perspective of each character (a bandit, a samurai, samurai’s wife and a woodcutter) this present study aims to highlight some different, but complementary, aspects of the full dynamic repertoire of DNA macromolecules. In the first part of this thesis, I will demonstrate that DNA, according to a peculiar three dimensional arrangement, is not only a simple recipe for proteins production but something more. In particular, I will focus on guanosine quadruplex structure, a not canonical B-form of DNA could be described through multiple points of view. On one side, synthetic guanosine quadruplex can act as “smart” biomolecules able to recognize multiple targets, with potential implications both as diagnostic as well as therapeutic agent. This short DNA/RNA sequences, called aptamers, according to a unique molecular flexibility, are able to recognize and bind a broad range of targets with specificities reminiscent those exhibited by antibodies. As working model, here I will present a detailed characterization in vitro of not physiological guanosine rich sequences able to bind human thrombin, a protein of physiological and pathological relevance. Our research was aimed to describe the relative role of the structural modules composing their molecular architecture. This allowed us to propose a structure activity relationship of synthetic G quadruplex aptamers, in order to fully rationalize and optimize their binding property. On the other side, G-quadruplex forming sequences are also found in human genome. Some of them have been described as unique biochemical on/off switch able to regulate tumorigenic pathways. In particular, the expression of the oncogene c-Myc is controlled through the formation of non–B-form DNA structures within its promoter. The conformational shift of this promoter between a transcription inactive form (G-quadruplex form) to an active one (a canonical double strand form) is strictly regulated by several nuclear proteins. In the second section I’ll present a study concerning the heterologous expression, the purification scheme of the resulting products and the biochemical characterization of the functional domains of human nucleolin, a nucleolar protein that is able to inhibit c-Myc oncogene transcription by a peculiar recognition of its promoter in a G quadruplex form. This approach was pursued to deeper clarify the mechanism of this binding event. Doubtless, this represents a promising goal in order to develop new selective and effective chemotherapy drugs. Although revolutionary, the idea that genetic information was encoded only by DNA sequence, in a protein-free mechanism has been appeared definitely too simplistic. Indeed, in organisms with nuclei chromosomal DNA is organized along with protein templates (histones), forming a complex called chromatin. This is target of diverse array of posttranslational modifications that modulate the interaction among chromatin-associated proteins, which ultimately dictate dynamic transitions between transcriptionally active (euchromatin) or transcriptionally silent chromatin states (heterochromatin). In the last section, I will focus on the structural insights standing on the recognition event between a modified histone N-terminal tail and a specialized ‘effector’ protein (ORC1b), generally known for its role in pre-replication complex assembly. The identification of the molecular details that clarify how distinct protein modules are able to recognize specific histone modifications is a critical step to understanding how chromatin dynamics influence fundamental DNA-templated processes such as transcription, DNA recombination and DNA repair. In particular, our results identify the tandem PHD-BAH domains of Arabidopsis thaliana ORC1b as a novel unmethylated-lysine-binding module, thereby establishing the first direct link between histone methylation grade and the epigenetic role of ORC1b, previously known as a transcriptional regulation factor only for a series of specific interactions with silencing regulators.

Il dogma fondante della biologia molecolare afferma che le informazioni genetiche sono decodificate attraverso un ordinato flusso logico, che parte dal DNA e passando attraverso il RNA arriva alla sintesi proteica. Per lungo tempo, all’interno di questo assunto, il DNA è stato esclusivamente considerato come il deposito biochimico delle informazioni genetiche. Con un ottica totalmente differente, in questo lavoro di tesi di dottorato presenterò tre aspetti, differenti ma complementari dell’intero repertorio funzionale del DNA. La prima sezione di questa tesi è rivolta ad un dettagliato studio degli aptameri leganti la trombina, ovvero sequenze non fisiologiche di DNA capaci di riconoscere selettivamente il target proteico in funzione di una specifica conformazione formata da quartetti di polideossiguanosine. Mediante una precisa caratterizzazione biofisica dei polimorfismi strutturali e dei profili di legame abbiamo potuto proporre delle solide ipotesi sul ruolo degli elementi modulari che ne compongono l’architettura molecolare, al fine di razionalizzare ed eventualmente incrementarne la capacità di riconoscimento del substrato proteico. Diversamente, porzioni di DNA capaci di autoassemblarsi in quartetti di guanosina sono state identificate all’interno del genoma umano. Alcune tra queste sono state descritte come straordinari interruttori biochimici capaci di regolare i processi tumorali. Nello specifico, l’espressione dell’oncogene c-Myc è fortemente controllata attraverso la formazione di strutture di DNA non canoniche all’interno del suo promotore. Questo equilibrio conformazionale del promotore tra una forma inattiva trascrizionalmente (struttura a quartetti di guanosina) ed una attiva (la canonica forma a doppia elica) è assistito e modulato da svariate proteine nucleari. Nella seconda parte del mio lavoro di tesi presenterò uno studio inerente all’espressione eterologa, la purificazione proteica del prodotto ricombinante e la caratterizzazione biochimica dei domini funzionali della nucleolina umana, una proteina nucleolare capace di inibire la trascrizione dell’oncogene c-Myc attraverso un peculiare riconoscimento del suo promotore nella sua forma silente. Questo approccio è stato perseguito al fine di porre le prime basi per l’identificazione del meccanismo di riconoscimento proteina – DNA, fortemente implicato nella soppressione tumorale. Anche se rivoluzionaria, l’idea che le informazioni genetiche siano codificate solamente all’interno della sequenza del DNA, secondo un meccanismo che contempla le proteine solo come “lettori” di questo codice, appare un concetto decisamente desueto. Il DNA cromosomiale, infatti, è organizzato su strutture proteiche (istoni) per le quali è stato esclusa una funzione esclusivamente “strutturale”. E’ stato dimostrato, infatti, che tali proteine sono soggette ad una serie di modifiche post trasduzionali che regolano attivamente l’attivazione e l’inibizione della trascrizione del DNA. Nell’ultima sezione presenterò uno studio finalizzato a chiarire i dettagli molecolari del riconoscimento tra un frammento istonico e i domini funzionali dell’effettore atORC1b (origin recognition complex 1b di arabidopsis thaliana). L’identificazione dei meccanismi molecolari mediante i quali distinti moduli proteici riconoscono le specifiche modificazioni istoniche rappresenta un passaggio chiave nella comprensione di fondamentali processi cellulari come la trascrizione, la ricombinazione cromosomiale e la riparazione del DNA. Nello specifico, il nostro studio ha evidenziato come i domini PHD e BAH dell’ORC1b, opportunamente combinati, possono agire come moduli di lettura del frammento N-terminale dell’istone 3 nella sua specifica forma non metilata. Tale evidenza, per la prima volta, dimostra una correlazione diretta tra il grado di metilazione dell’istone e il ruolo epigenetico dell’ORC1b, precedentemente noto come regolatore indiretto della trascrizione solamente in funzione di interazione specifiche con fattori eterocromatinici.