Studio dell'attività antiossidante di metaboliti secondari da piante medicinali nella prevenzione del danno vascolare

Oxygen and nitrogen-derived free radicals play an important role in the pathogenesis of several human diseases including neurodegeneration, chronic inflammation, cancer and cardiovascular disorders such as atherosclerosis, ischemic heart disease and hypertension. Epidemiological and experimental studies suggest the hypothesis that oxidative modifications of the endothelium and low-density lipoproteins (ox-LDLs) are crucial targets for the lipid-induced initiation and progression of atherogenesis; therefore, the preservation of the endothelial antioxidant capacity and the inhibition of LDL peroxidation by specific antioxidants are an attractive strategy to prevent and possibly to treat atherosclerosis and other related cardiovascular disorders. Baicalein (from Scutellaria baicalensis G.), (-)-bilobalide (Ginkgo biloba L.), eupatorin (Eupatorium semiserratum DC.), galangin (propolis), magnolol (Magnolia officinalis L.), myricetin (Myrica rubra S.Z.), oleuropein (Olea europaea L.) and silybinin (Silybum marianum L.) are plant-derived compounds widely used in traditional medicine: the aim of this study was to investigate their radical-scavenging capacity, in order to prevent ox-LDLs generation and endothelial dysfunction, using different in vitro and ex vivo assays. Antiradical properties were firstly analysed using both 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) and oxygen radical absorbance capacity (ORAC) scavenging assays, in that these methods rely on either single electron transfer or hydrogen atom transfer reaction kinetics. The DPPH assay was set in a final concentration range of 10^-7–10^-2 M, confirming a remarkable reducing capacity for each phenolic compound, especially for myricetin, oleuropein and baicalein. The ORAC detection proved that oleuropein, myricetin and magnolol are the most active compounds. In both DPPH and ORAC assays, the compound (-)-bilobalide did not show any noteworthy antioxidant activity. Oxidation of LDLs may provide the crucial link between plasma LDL and atherogenesis: for this reason, the antioxidant effect of each compound was studied on the susceptibility of human LDLs to oxidation. A determination of the extent of LDL oxidation was pointed out spectrophotometrically by measuring the formation of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), after incubation with 10 microM CuSO4, and by monitoring the oxidation kinetics profile of LDL particles at 234 nm. Free radical damage to lipids results in the production of malondialdehyde (MDA), which reacts with thiobarbituric acid under conditions of high temperature and acidity generating a chromogen; the lowest levels of TBARS, measured as nMol MDA/mg LDLs, were observed for oleuropein 2.5 microM and baicalein 5.0 microM. The kinetic of LDL oxidation was studied using the lag time index. Magnolol, oleuropein and myricetin (0.5 microM) exhibited a significantly higher LDL protection degree than the other polyphenols, with a considerable prolongation of the lag phase. Besides these evaluations, we used human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) primary cultures to investigate ROS production. The HUVECs represent an interesting model which plays a pivotal role in the study of different patophysiological processes, including arterial disease. The protective function of antioxidants towards oxidative stress was measured in a range from 0.01 microM to 5 microM through the dichlorofluorescin assay, a fluorimetric probe used to evaluate the intracellular peroxides generation. ROS detection was carried out both in basal conditions and after 500 microM H2O2 addition, as an external oxidative stimulus. In basal conditions, the phytoconstituents showed a mild antioxidant activity, even at different specific concentrations, highlighting an heterogeneous trend. Under H2O2-induced oxidative stress, galangin 5 microM showed higher antioxidant activity, and myricetin showed a significant antioxidant profile at 0.01 microM, 0.1 microM and 5 microM, even if in a less extent. The results suggest the polyphenolics as a possible strategy against the oxidative stress-related disorders as atherosclerosis. This encourages the future research of plant-derived compounds as effective antioxidant agents, in order to decrease ox-LDLs production in vivo and to provide a suitable basis for novel pharmacological development against free radicals damage.

Le specie reattive dell’ossigeno e dell’azoto rivestono un ruolo importante nella patogenesi di numerose malattie, tra le quali la neurodegenerazione, l’infiammazione cronica, il cancro e le malattie cardiovascolari come l’aterosclerosi, le cardiopatie ischemiche e l’ipertensione. Studi sperimentali ed epidemiologici suggeriscono l’ipotesi che le modificazioni ossidative a carico dell’endotelio e delle lipoproteine a bassa densità (ox-LDL) rappresentano un fattore di cruciale importanza per l’iniziazione e la progressione dei processi aterosclerotici; preservare perciò l’integrità endoteliale e inibire la perossidazione delle LDL rappresenta una valida strategia per prevenire e, probabilmente, trattare l’aterosclerosi ed altri disordini cardiovascolari. Baicaleina (estratta da Scutellaria baicalensis G.), (-)-bilobalide (Ginkgo biloba L.), eupatorina (Eupatorium semiserratum D.C.), galangina (propoli), magnololo (Magnolia officinalis L.), miricetina (Myrica rubra S.Z.), oleuropeina (Olea europaea L.) e silibinina (Silybum marianum L.) sono composti di origine vegetale ampiamente utilizzati in medicina tradizionale nella cura di svariate malattie. Lo scopo di questo studio è stato focalizzato sulla determinazione della loro capacità antiradicalica, al fine di prevenire la formazione di ox-LDL ed attenuare la disfunzione endoteliale, ricorrendo all’impiego di diversi saggi in vitro ed ex vivo. Le proprietà antiradicaliche dei metaboliti secondari sono state inizialmente studiate ricorrendo ai saggi: a) dell’1,1-difenil-2-picrilidrazile (DPPH) scavenging assay, e b) dell’oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay. Si tratta di metodi che si avvalgono di cinetiche di reazione basate sul trasferimento di singolo elettrone o mediante cessione di un atomo di idrogeno. Il DPPH scavenging assay è stato eseguito entro un intervallo di concentrazioni compreso tra 10^-7 M e 10^-2 M confermando una notevole capacità riducente per ciascun composto polifenolico, specialmente per miricetina, oleuropeina e baicaleina. L’analisi ORAC ha indicato come oleuropeina, miricetina e magnololo siano i composti più attivi. In entrambi i protocolli, il composto (-)-bilobalide non ha mostrato alcuna attività degna di nota. I processi di ossidazione delle LDL potrebbero, di fatto, rappresentare il nesso cruciale tra LDL plasmatiche ed aterogenesi: per questa ragione l'effetto antiossidante di ciascun composto è stato studiato in relazione alla suscettibilità delle LDL umane all'ossidazione. La determinazione del grado di ossidazione delle LDL è stata rilevata misurando la formazione di specie reattive dell’acido tiobarbiturico (TBARS), a seguito dell’incubazione con CuSO4 10 microM e monitorando il profilo cinetico di ossidazione delle LDL a 234 nm. I danni radicalici provocati a carico della frazione lipidica si traducono nella produzione di malondialdeide (MDA), una molecola in grado di reagire con l'acido tiobarbiturico in condizioni di alta temperatura ed acidità generando un addotto cromogeno; i composti oleuropeina 2.5 microM e baicaleina 5 microM hanno evidenziato i minori valori di TBARS, misurati come nMol MDA/mg LDL. Il profilo cinetico delle LDL trattate con ciascun fitocostituente è stato studiato ricorrendo all'indice di lag time. Alla concentrazione di 0.5 microM il magnololo, l’oleuropeina e la miricetina hanno mostrato un grado di protezione delle LDL significativamente più elevato rispetto agli altri polifenoli, con un notevole prolungamento della fase di latenza. Successivamente, si è passati allo studio delle colture primarie di cellule endoteliali umane isolate da vena ombelicale (HUVEC), per indagare la produzione di ROS. Le HUVEC rappresentano infatti un modello di fondamentale importanza nello studio di diversi processi patofisiologici correlati al sistema vascolare. L’attività degli antiossidanti nei confronti dello stress ossidativo è stata misurata nell’intervallo di concentrazione 0.01 - 5 microM mediante il saggio della diclorofluorescina, una sonda fluorimetrica impiegata per valutare la produzione intracellulare di perossidi. La determinazione delle specie reattive dell’ossigeno è stata condotta sia in condizioni basali, sia dopo l'aggiunta di H2O2 500 microM. In condizioni basali, i fitocostituenti hanno mostrato una modesta attività antiossidante mentre in condizioni di stress ossidativo indotto da H2O2, la galangina 5 microM ha dimostrato un più spiccato carattere antiossidante; anche la miricetina ha mostrato un profilo antiossidante significativo a 0.01 microM, 0.1 microM e 5 microM, anche se di minore entità. I risultati ottenuti in vitro suggeriscono che i polifenoli rappresentano una classe di composti naturali in grado di contrastare le disfunzioni ossidative legate all’aterosclerosi. Tali evidenze sperimentali incoraggiano la ricerca futura di derivati vegetali come efficaci agenti dotati di attività antiossidante anche in vivo, al fine di limitare la produzione di ox-LDL e fornire un adeguato presupposto per lo sviluppo di farmaci contro i danni provocati dalle specie radicaliche, in particolare a livello cardiovascolare.