Genomic instability at common fragile site FRA3B in normal human cells in the absence of aphidicolin-induced replication stress

Fragile sites (FS) are large genomic regions preferentially exhibiting chromosomal gaps or breaks at metaphase after partial inhibition of DNA replication. FS can be classified as either rare or common, according to the frequency of 'expression' (i.e. chromosome breakage) within the population. FS may be further classified according to the specific mode of induction in vitro (Durkin and Glover, 2007; Lukusa and Fryns, 2008). Rare fragile sites occur in less than 5% of the human population and they are characterized by the presence of di- or tri-nucleotide repeats. Rare fragile site segregate as Mendelian traits, and their expression can be associated with pathological phenotypes. Common fragile sites (CFS) are a normal component of the human chromosome, however they may be expressed with variable efficiency in different human subjects. One key question is whether CFS may be considered stable in vivo under physiological conditions. CFS are not characterized by a repeat motif, but they may contain interrupted stretches of AT dinucleotide repeats with a potential to form stable DNA secondary structures that can perturb the progression of the replication fork (Mishmar et al., 1998; Lukusa and Fryns, 2008). This correlates with the expression of instability at the fragile site, because secondary structures can induce double strand breaks (DSB). FRA3B is the most active common fragile site in the human genome; it is located at 3p14.2 (Saldivar et al., 2010) and the fragility core lies in the tumour-suppressor gene FHIT (Durkin et al., 2008). It is rearranged in several tumours, and the great majority of alterations are submicroscopic, intralocus deletions of hundreds of kilobases whose origin may be linked to replication stress conditions (Durkin et al., 2008). In this work the stability of the sequence at FRA3B, and its replication profile, were evaluated in different normal cell types in the absence of aphidicolin-induced replication stress, by fluorescence microscopy on single elongated DNA molecules (molecular combing). FISH experiments on combed DNA permits to analyse specific genomic regions and to evaluate their possible instability, because the spatial arrangement of different probes reflects the real distances along the molecule (Michalet et al., 1997). Differentially labelled genomic probes were used to study the genomic stability of the FRA3B fragility core. This study showed that in different types of normal human cells a small but relevant percentage of abnormal hybridization patterns (in the range 1-14%) was present within the FRA3B fragility core and three cases of sequence duplications were also observed. Unstimulated and stimulated peripheral blood lymphocytes from healthy donors, as well as immortalised, lymphoblastoid cell lines, showed similar proportion of sequence abnormalities (about 11%). The results on non-proliferating lymphocytes demonstrated that these abnormal patterns were present in vivo, in the absence of proliferation activity. In addition, by these data it is possible to exclude an in vitro effect in culture. The sequence abnormalities did not represent a specific feature of lymphoblastoid cells, because also in human primary fibroblasts (IMR-90) abnormal hybridization patterns were observed. By comparing different population doublings (PD) it appeared a positive trend with respect to the frequency of aberrant patterns, suggesting that the proliferation activity can be co-related with the FRA3B sequence instability observed under normal conditions. To confirm the sequence-specificity of our observations, a non-fragile region and another common fragile site (FRA6E) were analysed by the same dual-colour FISH approach. The results demonstrated that the observed abnormalities are specific for the FRA3B locus. The low proportion and uniqueness of these anomalies within each cell population, did not permit the use of sequence approaches to clarify their biological meaning. As alternative, clonal population were set up from TK6 lymphoblastoid cells in order to monitor the frequency of abnormal patterns in clonal cell progenies. 59 independent clones were generated. Structural analysis of the sequence was carried out on four clonal cultures randomly chosen among the 59 populations available generated. By comparing two harvest times (18 and 38 days of clonal proliferation) it was found a significant decrease of sequence abnormalities with respect to the starting population, followed by a positive trend of abnormal patterns in the second time of harvest. These results suggest that instability at FRA3B occurs in the progeny of a normal cell during proliferation, and may cause a progressive accumulation of heterogeneous sequence abnormalities. A similar approach on combed DNA allowed us to verify a specific fragility at FRA3B during molecular combing. This effect may be due to the presence of secondary structures favouring the formation of DNA breaks during the stretching of DNA. Through molecular combing it is also possible to evaluate the replication dynamics of a cell population, both at whole genome level and at single locus. By immunofluorescence and FISH experiments, replication origins can be mapped, and fork rate and inter-origin distance (IOD) can be calculated; in addition, replication parameters can be classified as bidirectional, unidirectional, paused/arrested replication forks, asynchronous forks (Schurra and Bensimon, 2008). In this study, replication analyses were carried out on primary lymphocytes and primary fibroblasts. At the whole genome level, a remarkable and unexpected fraction of the mammalian genome was found to be replicated by unidirectional forks, depending on the cell type. In addition, unidirectional forks increased in IMR-90 along PD. Data of fork rates and IOD at the whole genome level confirm that the two replication parameters are tightly co-regulated (Conti et al., 2007). Although FRA3B is late replicating, a feature which was clearly associated to the expression of fragility (Wang et al., 1999), no specific or abnormal replication patterns were detected at FRA3B. This is in agreement with our data concerning another CFS, FRA6E (Palumbo et al., 2010). In fact, replication parameters of single loci (fragile or non-fragile region) are characterised by common differences (in particular slow fork speed and high IOD values) with respect to the whole genome data, but do not suggest specific profiles for CFS. Recently, a possible role of transcriptional activity in CFS-associated long genes, including FHIT, was described with respect to the manifestation of CFS instability (Helmrich et al., 2011). The transcriptional activity at FRA3B may be positively co-related with the sequence abnormalities, because I found that only a very low activity is present in human fibroblasts, the cell type with the lowest proportion of merging patterns among those considered. FRA3B is highly conserved and Fra14A2 is the murine orthologue (Helmrich et al., 2006) that can be an interesting model to understand the mechanisms of instability of human CFS. In this study the experimental conditions requested to start a molecular combing study on the murine orthologue of FRA3B were set up and a protocol for the molecular combing of epididymal sperm DNA was developed. The replication profile of mouse embryonic fibroblasts (MEF) was verified at the whole genome level and it appeared highly comparable with our data obtained on human fibroblasts. By dual-colour FISH genomic instability at Fra14A2 was confirmed on MEF cells, and a first preliminary study on epididymal spermatozoa DNA suggested that Fra14A2 instability could be present also in mature gametes representing a possible factor of genetic risk for the progeny. To the best of my knowledge, this study reports the first direct observation of occurrence of chromosome instability at a fragile site in normal human cells in the absence of induced aphidicolin-replication stress or pathological conditions. Remarkably, the same sequence abnormalities here described at FHIT would remain undetected or not interpreted through genome-wide analyses, due to their low frequency and heterogeneity.

I siti fragili sono loci che presentano interruzioni cromatiche (gap) o rotture in cromosomi di cellule esposte a parziale inibizione della replicazione del DNA. Queste regioni genomiche possono essere classificate in rare e comuni sulla base della frequenza di 'espressione' (ossia rottura cromosomica) nella popolazione. Queste due classi si distinguono inoltre per il meccanismo di induzione in vitro della rottura (Durkin and Glover, 2007; Lukusa and Fryns, 2008). I siti fragili rari sono presenti in meno del 5% della popolazione e sono caratterizzati dalla presenza di ripetizioni di- o tri-nucleotidiche. Essi segregano in maniera mendeliana e la loro espressione può essere associata a fenotipi patologici. I siti fragili comuni sono una componente normale della struttura dei cromosomi, tuttavia la loro probabilità di espressione citogenetica è variabile da individuo ad individuo. Una questione chiave riguarda la loro possibile stabilità in vivo in condizioni fisiologiche. I siti fragili comuni non presentano una chiara sequenza consenso (motivi ripetuti), ma contengono tratti ricchi in ripetizioni dinucleotidiche AT in grado di creare strutture secondarie che potrebbero interferire con la progressione della forca replicativa (Mishmar et al., 1998; Lukusa and Fryns, 2008). Questa caratteristica correla con l'espressione d'instabilità ai siti fragili in quanto le strutture secondarie possono indurre rotture a doppio filamento. FRA3B è il sito fragile comune più attivo nel genoma umano; esso è localizzato sul cromosoma 3 in posizione p14.2 (Saldivar et al., 2010) e il centro di fragilità (core) è definito in FHIT, gene oncosoppressore (Durkin et al., 2008). Tale gene è riarrangiato in diversi tumori, e la maggior parte delle alterazioni sono delezioni sub-microscopiche da 10 a 100 kb che possono essere legate a condizioni di stress replicativo (Durkin et al., 2008). In questo lavoro, tramite microscopia a fluorescenza su singole molecole elongate di DNA (molecular combing), sono stati studiati sia la stabilità della sequenza di FRA3B che il suo profilo di replicazione in diverse cellule umane, in assenza di stress replicativo indotto da afidicolina. Esperimenti di ibridazione in situ fluorescente (FISH) su molecole stese di DNA permette di analizzare regioni genomiche specifiche e di valutare la loro possibile instabilità, in quanto la posizione tra le sonde riflette la reale distanza lungo le molecole (Michalet et al., 1997). Due sonde marcate con nucleotidi differenti sono state usate per studiare la stabilità genomica del core di fragilità di FRA3B e hanno dimostrato la presenza di una piccola ma rilevante percentuale di pattern con ibridazione anomala (1-14%) in cellule cresciute in condizioni fisiologiche. Inoltre sono stati osservati tre casi di duplicazione di sequenza. In linfociti stimolati e non stimolati di sangue periferico di donatori sani e in linee cellulari linfoblastoidi sono state osservate proporzioni simili di sequenze anomale (circa 11%). La presenza di questi pattern in linfociti non stimolati indica che queste anomalie di sequenza sono presenti in vivo anche in assenza di proliferazione cellulare. E' possibile così escludere un effetto della coltura in vitro. Questi pattern anomali non sono una caratteristica specifica delle cellule linfoblastoidi in quanto risultano presenti anche in fibroblasti umani (IMR-90). Inoltre, confrontando differenti passaggi in coltura, si può osservare una tendenza all'aumento di questi pattern che suggerisce una possibile correlazione con l'attività proliferativa in normali condizioni di crescita. Per confermare la specificità di sequenza delle nostre osservazioni, con lo stesso approccio di FISH a doppio colore sono stati analizzati una regione non fragile e un altro sito fragile comune (FRA6E). Questi dati dimostrano che le anomalie di sequenza osservate sono specifiche per il locus FRA3B. La bassa frequenza e unicità di queste anomalie in ogni popolazione cellulare analizzata non ci permette di usare tecniche di sequenziamento per chiarire il loro significato biologico. In alternativa, in questo studio sono state allestite 59 popolazioni clonali da cellule linfoblastoidi TK6 per monitorare la frequenza di queste anomalie di sequenza. Lo studio è stato effettuato su quattro di questi cloni cellulari campionati a caso, a due tempi di coltura diversi (18 e 38 giorni). I dati dimostrano una diminuzione significativa della proporzione di anomalie al primo tempo di raccolta rispetto alla popolazione di partenza, e analizzando i risultati ottenuti al secondo intervallo definito emerge una tendenza all'aumento. Quest'analisi suggerisce che l'instabilità di FRA3B avviene nella progenie di una cellula normale durante la proliferazione e potrebbe causare un progressivo accumulo di sequenze anomale ed eterogenee tra loro. In questo lavoro inoltre è stato verificato, con un approccio simile al precedente, una specifica fragilità di FRA3B in fase di molecular combing. Questo effetto potrebbe essere dovuto alla presenza di strutture secondarie favorenti la formazione di rotture durante l'estensione delle molecole di DNA. Con la tecnica del molecular combing è anche possibile valutare la dinamica di replicazione della popolazione cellulare sia a livello dell'intero genoma che a livello del singolo locus mappando le origini di replicazione e calcolando la velocità delle forche replicative e la distanza tra le origini. Inoltre le forche possono essere classificate come bidirezionali, unidirezionali, in pausa o arrestate e asincrone (Schurra and Bensimon, 2008). Queste analisi sono state effettuate su linfociti e fibroblasti primari. A livello dell'intero genoma, inaspettatamente una frazione significativa, che varia in base al tipo cellulare, è rappresentata da forche unidirezionali. Inoltre questo parametro di replicazione aumenta nelle IMR-90 in relazione ai passaggi in coltura. I dati sulla velocità delle forche e sulle distanze tra origini confermano che i due parametri replicativi sono strettamente correlati (Conti et al., 2007). Sebbene FRA3B sia un locus a replicazione tardiva, caratteristica legata all'espressione di fragilità (Wang et al., 1999), l'analisi non ha evidenziato parametri replicativi anomali o specifici delle regioni che replicano tardivamente, in accordo con quanto è già stato pubblicato nel nostro laboratorio riguardo al sito fragile, FRA6E (Palumbo et al., 2010). Infatti i parametri di replicazione a livello di singole regioni genomiche (fragili o non fragili) sono caratterizzati da differenze comuni (in particolare forche replicative lente e distanze tra origini elevate) rispetto ai dati osservati a livello di intero genoma, ma non si osservano profili di replicazione specifici per i siti fragili comuni. Recenti studi hanno dimostrato una possibile relazione tra l'attività trascrizionale di lunghi geni associati ai siti fragili comuni, incluso FHIT, e la loro instabilità (Helmrich et al., 2011). Valutando l'attività trascrizionale di FHIT nelle stesse linee cellulari analizzate per molecular combing, ci è possibile suggerire una correlazione con le anomalie di sequenza in quanto nei fibroblasti l'attività è molto bassa come anche la proporzione di pattern di sequenza anomali. FRA3B è altamente conservato e Fra14A2 è l'ortologo murino (Helmrich et al., 2006) che potrebbe essere un modello interessante per capire i meccanismi di instabilità dei siti fragili comuni umani. In questo lavoro sono state definite le condizioni richieste per avviare lo studio sull'ortologo murino di FRA3B con la tecnica del molecular combing ed è stato sviluppato un protocollo per elongare molecole di DNA di gameti maschili. La dinamica di replicazione a livello di intero genoma su fibroblasti embrionali murini (MEF) è risultata confrontabile con quella osservata su fibroblasti umani. Inoltre, attraverso la FISH a doppio colore, l'instabilità genomica di Fra14A2 sullo stesso tipo cellulare viene confermata e dati preliminari suggeriscono la presenza di instabilità di Fra14A2 anche in spermatozoi maturi, che potrebbe rappresentare un possibile fattore di rischio genetico per la progenie. Questo studio riporta una prima osservazione diretta di instabilità genomica ai siti fragili comuni in cellule normali cresciute in condizioni fisiologiche. E' importante evidenziare inoltre che le stesse anomalie di sequenza qui descritte potrebbero rimanere non analizzabili e non interpretabili in analisi genomiche a causa della loro bassa frequenza ed eterogeneità.