Studio del ruolo dell'infezione da Citomegalovirus umano nelle malattie infiammatorie croniche intestinali

Inflammatory bowel disease (IBD) patients are an emerging category of patients at risk of HCMV infection, because they are often immunosuppressed and because HCMV has preferential tropism for sites of inflammation. However, the role of the virus in this population of patients is still unclear. Current and most widely theories suggest that HCMV could be responsible for flares and/or make the patient develop resistance to medical treatment; besides, some data suggest that HCMV infection could be responsible for a more aggressive course of the disease. We still do not know if the flare of HCMV is related to a loss of competence of the immune system in IBD patients due to immunosuppressive medications or to the reactivation of the disease itself. Aims of the study were: 1) assessment of low-grade HCMV infection (microinfection) on colonic biopsies from a cohort of IBD patients and evaluation of the correlation with inflammation and the therapeutical regimen. 2) assessment of HCMV specific T-cell response in IBD patients in peripheral blood and evaluation of its possible correlation with disease activity and type of treatment. The first part of the study has been conducted on a retrospective cohort of consecutive non-selected IBD patients and controls (patients who performed colonoscopy for colorectal cancer screening or because of gastrointestinal symptoms, without any pathological finding at endoscopy and at histological examination). Intestinal biopsies were evaluated through a highly sensitive immunohistochemistry (IHC) protocol for HCMV immediate early (IE) and pp65 antigens. In addition real time PCR for HCMV IE-DNA and micro-RNA UL112 (the latest being involved in immune-evasion strategies) was performed. The HCMV-specific T cell response was evaluated in a prospective cohort of consecutive, non-selected IBD patients (in a cross-sectional and longitudinal study). For each patient the HCMV serology status was evaluated and in IgG-positive patients the HCMV-specific T-cell response was assessed in monocytes from peripheral blood (PBMCs), using an IFN-γ EliSpot assay. Patients were stratified according to the disease clinical activity indexes validated for Crohn'€™s disease (CD) and for ulcerative colitis (UC) and according to the therapeutic regimen. Levels of HCMV-specific immune response were considered normal if the EliSpot assay displayed at least 20 spot forming colonies (SFCs)/200000 PBMCs. The retrospective part of the study was conducted on 32 IBD patients (11 CD and 21 UC) and 8 controls; a total of 116 biopsies (collected during 55 different colonoscopies) were analyzed using IHC for HCMV antigens. 84 biopsies (72%) were collected on inflamed mucosa, while the remaining from uninflamed mucosa of IBD patients or from healthy mucosa from controls. IE-IHC was positive in 43% of the biopsies; none of them were from uninflamed mucosa; pp65-IHC was positive in 45% of biopsies, only one coming from a control patient. Intestinal inflammation was associated to an increased percentage of HCMV-IHC positivity; no difference was observed between biopsies collected from uninflamed mucosa of IBD patients and from control subjects. Immunosuppressive therapy (both monotherapy and combination therapy) was not associated with an increased risk of HCMV antigens positivity at IHC. However, non-immunosuppressed IBD patients were more frequently HCMV positive than controls. The study of HCMV IE-DNA expression was performed on 40 intestinal biopsies, with no evidence of HCMV in 65% of cases. In the positive cases the levels of expression were significantly inferior to the reference standard, with non difference between biopsies collected from inflamed and non-inflamed areas. A pilot study of the expression of HCMV UL112 microRNA has been performed on 24 biopsies; this microRNA was expressed in all the biopsies studied, however levels of expression were significantly inferior to the reference standard. In the prospective study 167 patients were enrolled and 125 (75%) were HCMV IgG-positive. 13% patients had low levels of HCMV-T cell specific response with a median value of 6 SFCs/200000 PBMCs (range 0-19). Twelve out of these 17 patients were on immunosoppressive therapy at the time of inclusion in the study. In 10 patients the disease was at least mildly active. The 29% of patients had moderate response (median 60.5 SFCs/200000 PBMCs (range 24-99); the majority of patients displayed a high HCMV specific immune response (median 199.5 SFC/200000 PBMCs (range 100-1000)). CD and UC patients displayed similar levels of specific response. Medical therapy did not influence the levels of immunity (in terms of number and types of immunosuppressors used). In particular, 19 patients tested before and after the beginning of anti-TNF therapy did not display a significant change in the specific levels of immunity. In conclusion, it seems plausible that latent virus could reactivate in inflammatory conditions, regardless the therapeutic regimen of the patient. On the other hand, the virus activates immune-evasion strategies in order to restore the latency status and ensure its own persistence in the host.

I pazienti affetti da malattia infiammatoria cronica intestinale (MICI) rappresentano una categoria emergente di soggetti a rischio di infezione/riattivazione di citomegalovirus (HCMV), data la natura infiammatoria della malattia e dato il sempre più frequente approccio terapeutico immunosoppressivo. Tuttavia il ruolo di HCMV in questa popolazione rimane ancora da chiarire. L'ipotesi attualmente più condivisa è che l'infezione, o più frequentemente la riattivazione virale, possa rappresentare un trigger di riaccensione della MICI e/o una causa di resistenza alla terapia medica. Tuttavia non è noto se tali evenienze siano da ricondurre ad una perdita di competenza del sistema immune nei confronti del virus secondaria alla terapia immunosoppressiva o alla esacerbazione della malattia infiammatoria cronica sottostante o al background immunologico proprio dei pazienti portatori di queste patologie. Particolare ruolo nella progressione di malattia potrebbe essere giocato dalla presenza di una microinfezione, ovvero di una infezione di basso grado, capace di mantenere uno stato di flogosi subclinica. Gli scopi dello studio sono: 1) valutare la frequenza di microinfezione da HCMV nella mucosa intestinale di pazienti affetti MICI e la relazione con la presenza di infiammazione e con il tipo di trattamento medico in corso; 2) valutare l'immunità cellulare T HCMV specifica nei soggetti con MICI in relazione all'attività di malattia e al tipo di trattamento medico in corso. Lo studio si è articolato in due parti: 1) la prima, retrospettiva, volta all'analisi di biopsie intestinali prelevate in corso di colonscopie eseguite per normale pratica clinica in pazienti consecutivi non selezionati. Sono state analizzate biopsie intestinali provenienti da pazienti con MICI e soggetti di controllo (che avevano eseguito colonscopia per screening o per sintomi gastrointestinali, senza riscontro tuttavia di alcuna lesione organica all'endoscopia e all'istologia). Le biopsie intestinali sono state analizzate mediante tecniche di immunoistochimica (IHC) ad alta sensibilità per la ricerca di microinfezione da HCMV (studio di antigeni "immediate early" (IE) e pp65). Da tali biopsie sono stati inoltre estratti DNA e RNA per l'analisi dell'espressione di IE-DNA e miRNA UL112 di HCMV (quest'ultimo implicato nei meccanismi di immuno-evasione) mediante Real Time-PCR. 2) La seconda parte dello studio, volta all'analisi dell'immunità cellulare T HCMV-specifica, si è articolata in una parte trasversale ed in una prospettica. Sono stati prelevati 10 ml di sangue periferico da pazienti con MICI consecutivi, non selezionati, afferenti alla SOC gastroenterologia. La stratificazione dei pazienti è stata eseguita sulla base degli indici di attività clinica di malattia validati per la malattia di Crohn (MC) e la colite ulcerosa (CU). Dai campioni di sangue periferico sono state estratte le cellule mononucleate (PBMCs), successivamente utilizzate nel saggio immunoenzimatico EliSpot dopo opportuna stimolazione con miscela di peptidi immunogenici di HCMV. Si sono considerati come normali livelli di immunità i casi che esprimessero almeno 20 spot forming colonies (SFCs)/200000 PBMCs. Nello studio retrospettivo sono stati inclusi 32 pazienti (11 con MC e 21 con CU) e 8 soggetti di controllo; sono state studiate mediante IHC complessivamente 116 biopsie intestinali raccolte nel corso di 55 esami endoscopici diversi. 84 su 116 biopsie (72%) provenivano da mucosa infiammata di soggetti con MICI; nei rimanenti casi da mucosa sana di soggetti con MICI o dai soggetti di controllo. Nel complesso, l'IHC per l'antigene IE di HCMV ha dato esito positivo nel 43% delle biopsie studiate; la totalità delle biopsie positive all'antigene IE proveniva da aree infiammate. L'IHC per l'antigene pp65 è risultata positiva nel 45% delle biopsie. In nessuna delle biopsie raccolte dai controlli è stata riscontrata positività per l'antigene IE, e solo in una biopsia è emersa una debole positività per pp65 in poche cellule epiteliali e della lamina propria. La positività ad entrambi gli antigeni è stata riscontrata più frequentemente nelle biopsie provenienti da mucosa infiammata rispetto a quelle provenienti da mucosa sana di soggetti con MICI. Questa maggior frequenza è stata riscontrata anche rispetto alle biopsie intestinali provenienti dai soggetti di controllo. Al contrario, non è emersa alcuna differenza statisticamente significativa nella frequenza della positività agli antigeni di HCMV nelle biopsie provenienti dai controlli rispetto a quelle provenienti da aree di mucosa esente da infiammazione di soggetti con MICI. La presenza di terapia immunosoppressiva al momento della colonscopia non è risultata associata ad un maggior rischio di avere l'IHC positiva per l'antigene IE o pp65, sia che fosse utilizzata in monoterapia che in associazione. Nel complesso, i soggetti affetti da MICI non immunosoppressi avevano tuttavia più frequentemente una positività antigenica rispetto ai soggetti di controllo, anch'essi non immunosoppressi (p = 0.001 per IE; p = 0.007 per pp65). Su 40 biopsie intestinali, provenienti da 30 differenti pazienti, è stato estratto il DNA ed eseguita la ricerca del genoma di HCMV mediante RT-PCR diretta contro il gene Major IE. Tale ricerca ha dato esito negativo in 26 casi (65%). I livelli di espressione del gene IE di HCMV sono risultati essere molto inferiori rispetto allo standard di riferimento (DNA proveniente da fibroblasti infettati in coltura), senza differenza significativa tra campioni provenienti da mucosa infiammata e non infiammata dei soggetti con MICI. Su 24 biopsie è stato eseguito uno studio di carattere esplorativo dell'espressione del miRNA specifico per HCMV UL112, riscontrandone la positività nel 100% dei campioni analizzati. Anche in questo caso i valori di espressione erano inferiori allo standard di riferimento. Nello studio prospettico volto a studiare l'immunità cellulare T HCMV-specifica nei pazienti affetti da MICI sono stati arruolati complessivamente 167 pazienti; di questi 125 (75%) erano già stati esposti all'infezione da HCMV, manifestando una sierologia IgG positiva. Il 13% dei pazienti ha dimostrato una bassa risposta immunitaria T-mediata nei confronti di HCMV, con una mediana di 6 SFCs/200000 PBMCs (range 0-19). Dodici di questi 17 pazienti stavano assumendo terapia immunosoppressiva. In 10 pazienti la malattia infiammatoria intestinale era almeno lievemente attiva secondo il corrispondente score clinico. Il 29% dei pazienti aveva una risposta HCMV-specifica intermedia, con una mediana di 60.5 SFCs/200000 PBMCs (range 24-99), mentre la maggioranza aveva una risposta elevata, con una mediana di 199.5 SFCs/200000 PBMCs (range 100-1000). Non sono stati osservati differenti livelli di immunità HCMV-specifica nella MC e nella CU, indipendentemente dallo stato di attività di malattia. La terapia medica in corso non è risultata influente sui livelli di immunità HCMV-specifica, sia nella MC che nella CU; il tipo di immunosoppressore (steroidi sistemici, tiopurine, biologici) o il numero di immunosoppressori in combinazione non si è associato a differenze significative nel numero di SFCs al test EliSpot. In particolare, 19 pazienti indirizzati alla terapia biologica anti-TNFα che sono stati valutati con IFN-γ EliSpot immediatamente prima di iniziare il trattamento e con un prelievo nel corso del mantenimento, non hanno subito una significativa modificazione dei valori di immunità. In conclusione, sembra plausibile che il virus che alberga in forma latente nell'organismo ospite risenta favorevolmente dell'ambiente infiammatorio tipico delle MICI in fase attiva e che sia questo a determinarne la riattivazione virale, indipendentemente dal trattamento medico in corso. Tuttavia, il virus metterebbe subito in atto meccanismi volti a ripristinare la fase di latenza per evitare che il sistema immune dell'ospite, riattivando ed espandendo il compartimento cellulare T HCMV-specifico, riesca a eliminare, almeno in parte, l'infezione.