Isolation and characterisation of mouse amniotic fluid stem cells: study of their origin, regenerative potential and reprogramming into pluripotent cells

Introduction: Stem cells are defined by their ability to proliferate for a long period of time, a property known as ‘self-renewal’, and to give rise to differentiated cells. Stem cells can be distinguished into totipotent, pluripotent, multipotent, oligopotent and unipotent. They can also be classified into embryonic, adult and fetal stem cells. Embryonic stem (ES) cells are obtained from inner cell mass (ICM) of blastocyst and are puripotent. Primordial germ cells (PGC) in the embryo give rise to gametes but they are not pluripotent, albeit they express Oct4, Nanog and Sox2. They can be reprogrammed in vitro, becoming pluripotent embryonic germ (EG) cells. Amniotic fluid stem (AFS) cells are fetal stem cells that can be isolated from the amniotic fluid (AF) by the expression of the marker c-kit, both in human and mouse, but their origin is unknown. Human AFS are multipotent in vitro, while both human and mouse AFS have hematopoitic potential, in vitro and in vivo. Recently it has been demonstrated that human AFS from first and second thrimester can be reprogrammend into pluripotent cells in vitro, after supplementation with Valproic Acid (VPA). Cells from the AF have also been used to obtain induced pluripotent stem (iPS) cells. For all these reasons AFS cells seems to be a promising sources of cells for regenerative medicine. Spinal muscular atrophy (SMA) is an autosomal recessive disease, caused by an homozygous deletion or mutation of the motor neuron 1 (SMN1) gene. Bone marrow (BM) transplantation in a murine model of SMA attenuates the myopathic phenotype without a full recovery and without long-term therapeutic effects. Aims of the thesis: Characterisation of fresh mouse AFS cells, evaluation of their myogenic potential into a model of SMA (HSA-Cre, SmnF7/F7 mouse) investigation of their putative PGC origin and induction to pluripotency through a non-viral method (PiggyBac, PB). Materials and Methods: Mouse AFS cells were obtained by amniocentesis and selected as c-kit+ cells with magnetic beads. Freshly isolated-AFS cells were analized for the expression of different markers (CD90, CD45, CD44, CD34, CD31, Flk1, Sca1, CD105) by flow citometry and the expression of Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4 and Sca-1 by qRT-PCR at different embryonic stages. Hematopoitic potential was evaluated in vitro, while the teratoma assay was performed in Rag2-/-γc-/- mice. For the reprogramming into EG cells cells were seeded into a feeder layer of mitotically inactivated STO or Sl4-m220, in a PGC medium supplemented with LIF and basic fibroblast growth factor (bFGF) and in N2B27 2iLIF medium. For the treatment of HSA-Cre, SmnF7/F7 mice, GFP+ cells were injected via the tail vain and sacrificed one month after transplantation. Tibialis Anteriour (TA) muscles were stained with hematoxylin and eosin, Masson’s trichrome and analized by immunofluorescence for positivity for GFP/dystrophin. The experiments for the origin of AFS have been conducted using two mouse models: Oct4-GFP and TNAP-Cre. For the induction to pluripotency cells were obtanied from Oct4-GFP positive embryos, and transfected with the PB-TET transposon plasmid containing four genes (Oct-4, Sox-2, c-Myc and Klf4) under the transcriptional control of the tetO2 tetracycline/doxycycline inducible promoter. The expression of pluripotency gene was induced with doxycycline. iPS cells obtained were tested for the expression of Nanog, SSEA-1 and for positivity to alkaline phosphatase. Results: Mouse AFS number chaged during the course of gestation. These cells expressed hematopoietic markers (CD45, CD34, Sca1), mesenchymal markers (CD90, CD105) together with Flk1, CD31 and CD44. On the basis of c-kit expression two populations were defined: c-kithigh and c-kitlow which showed differential expression of the aforementioned markers. c-kitlow are the more abundant, but during the course of gestation they decreases in numbers while the number of c-kithigh cells increases. Both populations had hematopoietic potential vitro. Gene expression analysis showed that mouse AFS cells expressed at low levels Oct4 and Sox2 and high levels c-Myc and Klf4, and their expression changed during the course of gestation. Single cell PCR showed that at E13.5 there 5% of cells co-expressed Oct4, Sox2 and Klf4. Mouse AFS cells didn't form teratoma. In the cell therapy experiments HSA-Cre, SmnF7/F7 control mice died at the age of 10 months, while mice treated with GFP+ AFS or bone marrow (BM) cells had a survival rates increased by 75% and 50% respectively. HSA-Cre, SmnF7/F7 mice treated with AFS cells recovered more than 75% of force compared to the untreated animals. One month after transplantation, muscles from AFS-treated mice displayed very low number of regenerating myofibers (<1%) and normal dystrophin expression; moreover, 37.86% (± 9.48%) of the fibers were GFP+. 15 months after transplantation BM-treated mice displayed a high number of central nucleated fibers and consistent infiltration of interstitial tissue and no GFP+ myofibers, while AFS-treated mice had a mild-phenotype, close to wild-type mice, and 58.00% (± 2.43%) of the myofibers were GFP+. Similar results were obtained with HSA-Cre, SmnF7/F7 treated with mouse AFS cells expanded in culture. To evaluate if mouse AFS cells were PGC cells, they were cultivated following the protocol established to obtain pluripotent EG cells from PGC cells. Two different culture protocols were used, but no EG cells were obtained. AFS cells isolated from Oct4-GFP fetuses at different embryonic stages showed no presence of Oct4+ cells. The TNAP-Cre line resulted to be unspecific. iPS clones obtained transfecting mouse AFS cells were doxycycline indipendent, they expressed Oct4, they were positive for Nanog and SSEA1, and for the alkaline phosphatase. Discussion: Mouse AFS cells are an heterogenous population, and their phenotype changed during the course of gestation. They expressed mesenchymal, hematopietic and endothelial markers. The two populations (c-kithigh and c-kitlow) should be tested in vivo to asses their differentiative potential. Gene expression analysis at population and single cells level confirmed the heterogeinity of mouse AFS cells. AFS showed a myogenic potential, even after long-term transplantion, suggesting an interesting therapeutic potential of these cells. AFS could contribute to the formation of new myofibers by fusing with existing ones or after integration within the stem cell niche of the muscle. The study of their origin suggested that mouse AFS cells aren't PGC. However it is important to remind that the Oct4-GFP mouse is not a lineage-tracking model; therefore more experiments are needed to confirm these results and to find the origin of these cells. iPS cells are a promising research tool to obtain a model of several diseases or as a source of cells for therapeutic approaches. Here it has been shown that the PB system is a suitable method for the reprogramming of mouse AFS cells. These are only preliminary results and more experiments will be necessary to complete the characterisation of these cells.

Introduzione: Le cellule staminali hanno la capacità di dare orgine ad una progenie di cellule mature mantendo la capacità di autorinnovamento. Possono essere distinte sulla base delle loro potenzialità in totipotenti, pluripotenti, multipotenti, oligopotenti e unipotenti. Possono anche essere distinte in cellule staminali embrionali, fetali e adulte. Le cellule staminali embrionali, ottenute dalla massa cellulare interna della blastocisti, sono pluripotenti. Nell'embrione le cellule primordiali germinali danno origine ai gameti, ed esprimono i marcatori di pluripotenza (Oct4, Nanog, Sox2), ma non sono pluripotenti. Esse possono essere riprogrammate in vitro, diventando così cellule germinali embrionali. Tra le cellule staminali fetali ci sono le cellule staminali del liquido amniotico (AFS). Queste cellule sono isolate dal liquido amniotico per la positività al marcatore c-kit e sono presenti sia nell'uomo che nel topo, anche se la loro origine embrionale non è nota. Le cellule AFS umane sono multipotenti in vitro; le cellule AFS umane e murine hanno uno specifico potenziale ematopoietico, in vivo e in vitro. Recentemente è stato dimostrato che le cellule AFS umane ottenute dal primo e dal secondo trimestre di gravidanza, possono essere riprogrammate in vitro in cellule pluripotenti, a seguito dell'aggiunta di acido valproico. Inoltre, le cellule del liquido amniotico sono state anche utilizzate da diversi gruppi di ricerca per ottenere cellule staminali indotte alla pluripotenza (iPS). Per questi motivi, le AFS rappresentano una sorgente innovativa di cellule per approcci di medicina rigenerativa. L'atrofia spinale muscolare (SMA) è una malattia autosomica recessiva, causata della delezione o mutazione omozigote del gene della sopravvivvenza del motoneurone 1 (SMN1). Il trapianto di midollo osseo in un modello murino di SMA attenua il fenotipo miopatico, tuttavia non lo recupera totalmente e non mostra alcun effetto benefico a lungo termine. Scopo della tesi: Gli scopi di questa tesi consistono nella caratterizazzione delle cellule murine AFS isolate a fresco, nella valutaione del loro potenziale miogenico dopo il trapianto in animali HSA-Cre, SmnF7/F7, nello studio della loro origine embrionale e nell'induzione alla pluripotenza usando un metodo non virale (PiggyBac, PB). Materiali e Metodi: Le cellule murine AFS sono state ottenute attraverso amniocentesi e successiva immunoselezione per il marcatore c-kit mediante biglie magnetiche. Le cellule AFS sono state analizzate per l'espressione di diversi marcatori (CD90, CD45, CD44, CD34, CD31, Flk1, Sca1, CD105) attraverso la citometria a flusso e per l'espressione di Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog e Sca-1, attraverso qRT-PCR , a diversi stadi embrionali. Sono stati valutati il potenziale ematopoietico in vitro e la capacità di formare teratomi in topi Rag2-/-γc-/-. Per la riprogrammazione a cellule embrionali germinali, le cellule AFS sono state seminate su feeder layer di STO o Sl4-m220, mitoticamente inattivato, con il terreno per le cellule primordiali germinali, supplementato con LIF e il fattore per la crescita dei fibroblasti (bFGF) e successivamente con il terreno N2B27 2iLIF. Per il trattamento dei topi HSA-Cre, SmnF7/F7 le cellule AFS isolate da topi GFP+, sia isolate a fresco che coltivate, sono state iniettate nelle vena della coda e i topi sono stati sacrificati un mese dopo trapianto ed i muscoli analizzati mediante ematossilina ed eosina, tricromica di Masson e con immunofluorescenza per l'espressione di distrofina/GFP. Per studiare l'origine embrionale delle cellule AFS sono stati utilizzati due modelli murini: Oct4-GFP e TNAP-Cre. Per l'induzione alla pluripotenza, cellule ottenute dai feti Oct4-GFP son state trasfettate con i plasmidi del trasposone PB-TET contenente quattro geni (Oct4, Sox2, c-Myc e Klf4) sotto il controllo trascrizionale del promotore inducibile tetO2 tetraciclina/doxiciclina. L'espressione dei geni della pluripotenta è stata indotta con la doxiciclina. Le cellule iPS così ottenute sono state testate per l'espressione dei marcatori Nanog, SSEA-1 e per la positività alla fosfatasi alcalina. Risultati: Le cellule AFS c-kit+ murine variano in numero durante il corso della gestazione. Queste cellule esprimono i marcatori ematopoietici (CD45, CD34, Sca1), mesenchimali (CD90, CD105) insieme a Flk1, CD31, CD44. Sulla base dell'epressione di c-kit sono state identificate due popolazione cellulari: c-kithigh e c-kitlow, che mostrano anche una differente espressione dei marcatori sopracitati. Le cellule c-kitlow sono presenti in numero maggiore e durante il corso della gestazione diminuiscono mentre le c-kithigh aumentano. Entrambe le popolazioni hanno un potenziale ematopoieitco in vitro. Le cellule murine AFS esprimono a bassi livelli i geni Oct4 e Sox2 e ad alti livelli c-Myc e Klf4, ma la loro espressione cambia durante il corso della gestazione. La stessa analisi eseguita a livello di singola cellula ha mostrato che allo stadio E13.5 il 5% delle cellule co-esprime Oct4, Sox2 e Klf4. Le cellule AFS murine non formano teratoma. Negli esperimenti di terapia cellulare topi HSA-Cre, SmnF7/F7 non trattati, morivano all'età di 10 mesi mentre topi trattati con le cellule AFS o cellule da midollo osseo non frazionato avevano una sopravvivvenza del 75% e del 50%, rispettivamente. I topi trattati con le cellule AFS, mostravano un recuperano della forza muscolare rispetto agli animali non trattati (+75%). I muscoli degli animali trattati con le cellule AFS mostravano una morfologia normale con un numero basso di fibre rigeneranti (<1%) e una normale espressione delle distrofina che per il 37.86% (± 9.48%) era GFP+. A 15 mesi dal trattamento, gli animali trattati con cellule del midollo osseo avevano un maggior numero di fibre centro nucleate e una consistente infiltrazione di tessuto interstiziale e nessuna fibra GFP+. Gli animali trattati con le cellule AFS mostravano un fenotipo migliore e il 58.00% (± 2.43%) delle fibre muscolari era GFP+. Risultati simili sono stati ottenuti trattando topi HSA-Cre, SmnF7/F7 con cellule AFS espanse in vitro. Per cercare di differenziare le cellule AFS in cellule embrionali germinali pluripotenti abbiamo testato due protocolli ma nessuna colonia che ricordasse cellule embrionali germinali si è formata in vitro. Le cellule AFS isolate dai feti Oct4-GFP erano GFP negative. Il modello TNAP-Cre è risultato essere aspecifico, perchè TNAP non risultava essere espresso solo nelle cellule germinali primordiali. Negli esperimenti di riprogrammazione, alcuni cloni di iPS hanno mostrato di essere doxiciclina indipendenti, esprimevano il gene Oct4 endogeno ed erano positivi per i marcatori Nanog e SSEA1 e per la fosfatasi alcalina. Discussione: Le cellule murine AFS sono una popolazione eterogenea, le cui caratteristiche variano durante il corso della gestazione ed esprimono marcatori ematopoietici, mesenchimali e anche marcatori tipici delle cellule endoteliali. Il potenziale differenziativo delle due popolazioni c-kithigh e c-kitlow dovrà essere testato in vivo. L'analisi dell'espressione genica a livello di popolazione e a livello di singola cellula per i marcatori della pluripotenza ha confermato l'eterogeneità delle cellule AFS. Il trattamento degli animali HSA-Cre, SmnF7/F7 ha mostrato un potenziale miogenico delle cellule murine AFS, anche a lungo termine, suggerendo un interessante potenziale terapeutico. Le cellule AFS potrebbero contribuire a generare nuove fibre muscolari fondendosi con fibre esistenti o integrarsi nelle nicchia delle cellule staminali muscolari, ma maggiori esperimenti saranno necessari per valutare la validità dell'ipotesi. Anche le cellue AFS coltivate hanno dimostrato il mantenimento delle proprietà rigenerative. Questo studio suggerisce che le cellule AFS murine probabilmente non derivano da cellule primordiali germinali. Tuttavia è importante ricordare che il modello murino Oct4-GFP non è un modello di lineage tracking. Maggiori esperimenti saranno necessari per confermare questi risultati e per identificare l'origine delle cellule AFS. Le cellule iPS sono un promettente strumento di ricerca come modello di malattia o nella speranza di ottenere una sorgente di cellule per terapia. Qui è stato dimostrato come il sistema del PB può essere un valido metodo per la riprogrammazione delle cellule murine AFS. Questi sono solo risultati preliminari e maggiori esperimenti saranno necessari per completarne la caratterizzazione.