Exploiting Drosophila as a model system for studying REEP1-linked HSP in vivo

Hereditary Spastic Paraplegia (HSP) is a genetic group of neurodegenerative disorders characterized by progressive degeneration of corticospinal tracts. Mutations in the SPG31 gene, encoding REEP1, are the third most common cause of autosomal dominant form of HSP. Recent studies have reported that REEP1, an integral ER membrane protein, interacts with the microtubule cytoskeleton to coordinate ER shaping. However it precise molecular function is still unknown. To better understand the function of REEP1, we generated a model (Drosophila melanogaster) for the in vivo analysis of the fly REEP1 homolog (D-REEP1). Drosophila and human REEP1 proteins display remarkable homology and conservation of domain organization. We analyzed D-REEP1 loss of function and gain of function transgenic lines as well as animals expressing pathological forms of the protein. Our in vivo data in Drosophila have shown a strong involvement of D-REEP1 in the regulation of lipid droplets (LDs) number and size in neuronal and non neuronal tissues. Loss of D-REEP1 results in larvae leaner and smaller than their wild type counterparts while endoplasmic reticulum membranes are elongated when compared to controls. These ER defects are associated with a decrease in lipid droplets number and low triglycerides content. On the contrary over expression of wild type D-REEP1 produces a reduction in the size of lipid droplets. The lack of animal models available for REEP1 studies and experimental data concerning the functional alteration caused by pathological mutations of REEP1 prompted to generate transgenic lines carrying D-REEP1 pathological mutations and to analyse the consequence of their expression in vivo. Two missense mutations (P19R, D56N) affecting the trans-membrane domains of REEP1 and a novel mutation (A132V) located in the C-terminal part of the protein have been assessed.The mutations in the trans membranes domains relocate REEP1 from the ER to the membrane of lipid droplets when expressed in mammalian cells. In vivo expression of Drosophila P19R caused oversized LDs in the brain and axons and increased levels of triacylgycerides. LDs are believed to originate from the endoplasmic reticulum, although the exact molecular mechanisms of their biogenesis is still not known. Based on the findings described above and the knowledge about REEP family, we hypothesize that REEP1 probably play an important role in membrane remodelling and possibly affects the lipid droplets metabolism. While, pathological forms of REEP1 could perturb the biogenesis and/or turnover of lipid droplets and eventually produce an imbalance in neuronal lipid metabolism

Le Paraplegie Spastiche Ereditarie (HSP) sono un gruppo eterogeneo di malattie neurodegenerative, caratterizzate da progressiva spasticità degli arti inferiori, e degenerazione del tratto corticospinale. Mutazioni a carico del gene SPG31, codificante per la proteina REEP1, sono la terza causa più comune di forme dominanti di HSP. Studi recenti suggeriscono che REEP1, una proteina integrale della membrana del reticolo endoplasmatico (ER), sia coinvolto nel rimodellamento delle membrane del ER attraverso l’interazione con i microtubuli del citoscheletro. Tuttavia la precisa funzione biologica e il meccanismo patologica di questa proteina sono ancora sconosciuti. Questa tesi ha come oggetto lo studio in vivo della funzione di REEP1 utilizzando come organismo modello Drosophila melanogaster. A tale scopo abbiamo identificato l’omologo in Drosophila di REEP1 (D-REEP1) e generato delle linee transgeniche per la modulazione dell’espressione genica in vivo sia della proteina wild type sia di alcune sue varianti patologiche. Analisi in vivo suggeriscono che D-REEP1 sia coinvolto nella regolazione del numero e della dimensione dei lipid droplets (LDs) in tessuti neuronali e non neuronali. L’assenza di D-REEP1 causa una riduzione delle dimensioni larvali e ad un allungamento delle membrane del reticolo endoplasmatico. Le alterazioni morfologiche del reticolo endoplasmatico sono associate ad una diminuzione del numero totale dei LDs e alla riduzione del contenuto dei trigliceridi. Al contrariola sovra-espressione di D-REEP1 in vivo induce una riduzione delle dimensioni dei LDs La mancanza di studi su organismi modelli e dati sperimentali per valutare le possibili alterazioni funzionali causate delle mutazioni patologiche di D-REEP1, ha portato a creare delle linee transgeniche di Drosophila per forme mutate di D-REEP1. In tal modo si è voluto valutare gli effetti, sia in vivo, che in vitro, di due mutazioni missenso (P19R, D56N) localizzate nei domini transmembrana ed una mutazione nuova (A132V), non ancora pubblicata, localizzata nella parte C-terminale di D-REEP1. Le analisi in vitro hanno dimostrato che le mutazioni situate nei domini transmembrana determinano una alterata localizzazione subcellulare di REEP1. Inoltre, la sovrespressione in vivo di D-REEP1-P19R determina un aumento delle dimensioni dei LDs nel sistema nervoso di Drosophila. Seppure si ritiene che la biogenesi dei lipidi avviene a livello del reticolo endoplasmatico, appare tuttora sconosciuto l’esatto meccanismo molecolare coinvolto. I dati da noi ottenuti e le conoscenze attuali riguardo la famiglia delle proteine REEP suggeriscono che, agendo sulla curvatura delle membrane del ER o reclutando particolari proteine dei LDs, REEP1 sia probabilmente importante nella generazione dei lipid droplets con possibili effetti sul metabolismo lipidico