Phenotypic characterization of mice lacking NG2 and therapeutic approaches to collagen VI myopathies

Collagen VI is a large extracellular matrix protein with a widespread distribution in several tissues. Mutations of genes encoding for collagen VI in humans cause various forms of muscular dystrophies, including Bethlem Myopathy (BM) and Ullrich Congenital Muscular Dystrophy (UCMD). Previous studies demonstrated that collagen VI null (Col6a1–/–) mice display an early onset myopathic phenotype affecting skeletal muscles, characterized by mitochondrial dysfunction, and impaired autophagy. Molecular pathway(s) transducing collagen VI signals are largely unknown. NG2 is a transmembrane proteoglycan acting as a cell surface receptor for collagen VI. NG2 is not only expressed by developing tissues and tumors but also by postnatal skeletal muscles and it is selectively down-regulated in myofibers from UCMD patients and Col6a1–/– mice. The first aim of my PhD work was to investigate the role of NG2 and its interplay with collagen VI in skeletal muscles. Although NG2 null (Cspg4–/–) mice appear phenotypically normal, careful investigation of muscles revealed that these mice are affected by a myopathic syndrome. In particular, Cspg4–/– myofibers showed increased incidence of apoptosis and dysfunctional mitochondria. When Cspg4–/– animals were subjected to voluntary exercise on running wheel, they displayed muscle weakness and decreased resistance to fatigue. Electron microscopy of Cspg4–/– mice revealed increased thickness of basement membrane and proliferation of pericytes in the capillary vessels of skeletal muscles. These ultrastructural alterations are remarkably similar to those detected in Congenital Myosclerosis, a rare human disorder recently linked to a peculiar COL6A2 mutation. These findings suggest that NG2 may influence pericyte homeostasis contributing to muscle fiber degeneration in collagen VI related diseases. Thus, the phenotype of NG2 null mice is partially similar to that of collagen VI null mice, pointing at an interaction between these two molecules in skeletal muscles. The second aim of my PhD work was to evaluate the therapeutic efficacy of NIM811, a non-immunosuppressive cyclosporin A derivative, in Col6a1–/– mice and in muscle cultures from patients affected by UCMD and BM. The results indicate that in vivo treatment of Col6a1–/– mice with NIM811 is very effective at normalizing the mitochondrial phenotype in muscle fibers and at reverting the apoptotic rate to a frequency close that observed in wild-type animals. Interestingly, 10 days of treatment with NIM811 showed a marked recovery of muscle strength in Col6a1–/– mice. Moreover, treatment with NIM811 delayed mitochondrial depolarization induced by both oligomycin and rotenone in muscle cultures from UCMD and BM patients. Considering the results obtained with NIM811 in Col6a1–/– mice and in patient cultures, that this drug has no immunosuppressive side-effect and that it is available, NIM811 appears very promising for clinical trial of both pediatric and adult patients affected by collagen VI myopathies.

Il collagene VI è una proteina della matrice extracellulare ampiamente distribuita in diversi tessuti. Le mutazioni a carico dei geni che lo codificano sono causa di diverse forme di distrofia muscolare umana, ed in particolare della miopatia di Bethlem (BM) e della distrofia muscolare congenita di Ullrich (UCMD). Studi precedenti hanno dimostrato che i topi privi di collagene VI (Col6a1–/–) mostrano un fenotipo miopatico ad esordio precoce, che interessa i muscoli scheletrici e che è caratterizzato da disfunzione mitocondriale ed alterazione dell’autofagia. Le vie molecolari che trasducono i segnali del collagene VI sono per lo più sconosciute. NG2 è un proteoglicano transmembrana che funge da recettore di superficie per il collagene VI. Esso è espresso non solo nei tessuti in via di sviluppo e nei tumori ma anche nei muscoli scheletrici adulti ed è selettivamente down-regolato nelle miofibre di pazienti affetti da UCMD e nei topi privi di collagene VI. Il primo obiettivo del mio dottorato è stato investigare il ruolo di NG2 e la sua relazione con il collagene VI nei muscoli scheletrici. Sebbene il topo privo di NG2 (Cspg4–/–) appaia fenotipicamente normale, un’attenta indagine sui muscoli ha rivelato che questi animali sono affetti da una sindrome miopatica. In particolare, le miofibre dei topi privi di NG2 hanno mostrato un’aumentata incidenza di eventi apoptotici e di mitocondri disfunzionanti. Quando i topi Cspg4–/– sono stati sottoposti ad esercizio volontario su ruote, hanno manifestato debolezza muscolare e ridotta resistenza alla fatica. La microscopia elettronica ha evidenziato un ispessimento della lamina basale dei vasi ed una proliferazione di periciti attorno a capillari dei muscoli scheletrici. Queste alterazioni ultrastrutturali sono assai simili a quelle riscontrate nei pazienti affetti da miosclerosi congenita, una rara malattia recentemente associata ad una particolare mutazione nel gene COL6A2. Questa scoperta suggerisce che NG2 potrebbe influenzare l’omeostasi dei periciti contribuendo alla degenerazione delle fibre muscolari in disordini associati ad alterazioni del collagene VI. Il fenotipo osservato nei topi privi di NG2 è quindi parzialmente simile a quello osservato nei topi privi di collagene VI, rafforzando l’ipotesi di un’interazione tra le due molecole nei muscoli scheletrici. Il secondo obiettivo del mio elaborato di tesi è stato valutare l’efficacia terapeutica di NIM811, un derivato non immunosoppressivo della ciclosporina A, in topi privi di collagene VI e in colture derivate da biopsie muscolari di pazienti affetti da UCMD e BM. Il trattamento in vivo con NIM811 nei topi Col6a1–/– è risultato essere molto efficace nel normalizzare il fenotipo mitocondriale nelle miofibre e nel riportare l’apoptosi a livelli confrontabili con i topi selvatici. È anche interessante osservare che 10 giorni di trattamento con NIM811 hanno permesso un significativo recupero della forza muscolare nei topi Col6a1–/–. Inoltre, il trattamento con NIM811 ha ridotto la depolarizzazione mitocondriale indotta da oligomicina e rotenone nelle culture muscolari da pazienti affetti da UCMD e BM. Considerando i risultati ottenuti con NIM811 in topi privi di collagene VI e culture da pazienti, l’effetto non immunosoppressivo e la disponibilità del farmaco, NIM811 appare davvero promettente per un trial clinico sia su pazienti pediatrici che adulti affetti da disordini muscolari associati ad alterazioni del collagene VI.