Amniotic fluid stem cell therapy in chronic kidney disease progression: the case of Alport syndrome

Chronic kidney Disease (CKD) is a global health problem. It is associated with gradual decline in renal function, which develops into end stage renal disease and culminates into renal failure. Many different etiological factors are involved in the initiation and progression of CKD. The two most prevailing medical reasons for the development of progressive kidney disease are diabetes and hypertension. Regardless of the site of the initial insult, which may either be the glomerulus or tubules, all forms of progressive kidney diseases follow a final common pathway that is interstitial and glomerular fibrosis together with loss of podocytes, therefore, loss of glomerular integrity and renal function. Current therapeutic options for CKD are few and limited to the administration of renin-angiotensin system blockers, dialysis and renal transplantation. Although, pharmacotherapies are effective in slowing down the rate of progression, they do not prevent end stage renal disease. On the other hand dialysis even though life sustaining does not solve the problem and is associated with very poor quality of life. Renal transplantation thus remains the most effective method to treat end stage renal disease, however, the shortage of donor organs and immune complications associated with it do not solve the problem either. Hence, development of novel therapies remains an urgent necessity. Stem cell approach to Regenerative Medicine introduces vast possibilities for new therapies in acute as well as chronic diseases where current treatment options are either limited or inadequate. Stem cells derived from amniotic fluid (AFSC), which have emerged in recent years, represent a new source of stem cells with pluripotential properties, devoid of ethical issue associated with embryonic stem cells. Previous studies have proven the principle that AFSC can be used in regenerative medicine of the kidney due to their strong immunomodulatory properties and showed renoprotection when injected into an acute renal failure injury model in rodents. The purpose of the current study was to investigate the role of stem cells derived from amniotic fluid in an animal model of chronic kidney disease. In particular, cells positively selected for CD117 (c-kit) were administered to mice with x-linked Alport Syndrome (XLAS), a well established genetic model to study chronic kidney disease. Alport disease is associated with mutations in the collagen type IV family of proteins, the a3, a4 and a5 chains, the absence of which alters the normal composition and function of the glomerular basement membrane leading to proteinuria, and ultimately loss of podocytes. We hypothesized that (AFSC) would be able slow down chronic progression in Alport kidneys by modulating key processes such as the immune response, pro-fibrotic events initiated by TGF- signaling and cytokine/chemokine profile of the kidney via endocrine/paracrine mechanisms protecting the glomerular structure and preserving the filtration property of the organ. Single dose of systemic injection of AFSC at an early stage of the disease, before the onset of proteinuria, prolonged the life-span of Alport mice by 20% on average. This also resulted into amelioration of the functional parameters of the kidney, lowered serum creatinine, BUN as well as proteinuria levels at 2.5 months post treatment. Treated kidneys demonstrated better morphology with less severe glomerulosclerosis, lesser deposition of collagen type I associated with interstitial fibrosis and reduced infiltration of macrophages and inflammatory cells compared to their non-treated siblings. AFSC were detectable in glomeruli of injected mice but they did not differentiate into podocytes, and consequently, the a5(IV) chain of collagen missing in Alport mice was not replaced by AFSC treatment. Our findings revealed significant downregulation of key regulatory cytokines, such as TNFa, CCL2, CXCL2 and M-CSF involved in pro-fibrotic M1 macrophage signaling pathway favoring tissue remodeling instead of tissue injury. Finally, Alport mice receiving AFSC demonstrated preservation of podocyte numbers. In a closer look, glomerular cells stimulated with Angiotensin II showed increased Angiotensin II receptor type 1 (ANGTR1) expression, which was downregulated when treated with losartan (Angiotensin II antagonist). Similar to losartan AFSC decreased ANGTR1 expression, suggesting that AFSC may block the effects of Angiotensin II favoring glomerular survival. In conclusion, AFSC slow down Alport progression via preservation of podocyte number, M2c activation of macrophages and modulation of kidney microenvironment through endocrine/paracrine mechanisms favoring tissue preservation and function, in particular preserving podocyte number and filtration property.

Negli ultimi anni l’aumento nell’incidenza della Malattia Renale Cronica (Chronic Kidney Disease, CKD) è diventata un importante problema di salute pubblica. Principale manifestazione clinica della CKD è un graduale declino della capacità di filtrazione del rene che termina con lo sviluppo di insufficienza renale terminale (End Stage Renal Disease, ESRD). Infezioni, infiammazioni acute e croniche, malattie genetiche o la presenza di patologie a carico di altri organi, come per esempio il diabete, possono concorrere o essere causa diretta di danno renale. Questi insulti possono portare ad una progressiva perdita della funzione renale fino a raggiungere lo stadio finale di ESRD. Indipendentemente dalle origini eziologiche, la CKD evolve con la progressione di fibrosi glomerulare e interstiziale, apoptosi dei podociti con conseguente distruzione della struttura morfo-funzionale del rene e della sua capacità di filtrazione. L’utilizzo di farmaci (come per esempio gli antiipertensivi ACE inibitori, o inibitori dell'anidrasi carbonica) spesso riesce a rallentare il progresso della malattia ma il trattamento farmacologico risulta essere meno efficace con il progredire dell’ESRD e può risultate nefrotossico con il passare del tempo. La dialisi, trattamento molto invasivo e costoso per la sanità, ed il trapianto con la scarsa disponibilità di organi e la crescente richiesta, hanno spinto alla ricerca di valide alternative con un minor costo sociale ed una maggior compliance da parte dei pazienti. Molti studi si sono focalizzati nella scoperta di nuove fonti di cellule staminali per il trattamento di malattie renali acute e croniche dove le terapie correnti sono insufficienti ed inadeguate. Negli ultimi anni, il liquido amniotico è stato proposto come fonte alternativa per l’isolamento di cellule staminali da poter utilizzare in futuro per la terapia cellulare e, con particolare riguardo, per la rigenerazione del tessuto renale. In particolare, in studi recentemente pubblicati, le cellule staminali da liquido amniotico (AFSC) si sono distinte per la loro potente azione antiinfiammatoria e renoprotettiva, con modulazione della risposta immunitaria in un modello murino di danno renale acuto. Lo scopo di questo lavoro è quello di investigare il ruolo delle cellule staminali da liquido amniotico in un modello animale genetico di danno renale cronico (CKD). Nello specifico, cellule positive per il recettore di membrana CD117 (c-kit) sono state infuse in un modello murino di Sindrome di Alport, riconosciuto come uno dei più utili modelli più utili per lo studio di malattie renali croniche. La Sindrome di Alport è una grave malattia ereditaria e progressiva dovuta a mutazioni che coinvolgono le catene a3, a4 and a5 del collagene di tipo IV. L’assenza di tali catene altera la composizione fisiologica della matrice extracellulare renale (GBM, glomerular basement membrane) e provoca una marcata perdita di funzionalità che conduce a proteinuria e, con il tempo, a perdita dei podociti con conseguente blocco della filtrazione glomerulare. Basandoci sui dati precedentemente ottenuti, in questo lavoro ipotizziamo che le cellule staminali da liquido amniotico abbiano la capacità di rallentare la progressione della CKD, tramite un’azione endocrina e paracrina su vari meccanismi patologici che includono la risposta immunitaria, la fibrosi indotta dall’attivazione di TGF-a . In aggiunta, ipotizziamo che l’azione positiva esercitata dalle cellule da liquido amniotico sia un effetto di mantenimento della struttura glomerulare con conseguente mantenimento della normale capacità di filtrazione. In particolare, una singola infusione di AFSC, amministrata nei primi stadi della malattia, è capace di prolungare la sopravvivenza nel modello murino di circa il 20% con un significativo miglioramento dei parametri fisiologici renali quali livelli di creatinina plasmatica, BUN e proteinuria, oltre due mesi dalla somministrazione. Inoltre, Il tessuto renale degli animali trattati presenta una morfologia normale con lieve sclerosi glomerulare ed una minore deposizione di collagene I, di solito associata a fibrosi interstiziale. A questo si accompagna una minore infiltrazione da parte di macrofagi e altre cellule del sistema immunitario rispetto agli animali non trattati. Una vasta serie di esperimenti è stata quindi effettuata per investigare i meccanismi di azione tramite cui le cellule staminali da liquido amniotico esercitano il loro effetto positivo. Gli animali trattati presentano un maggior numero di podociti se comparati con i topi di controllo. La presenza di cellule infuse nei glomeruli nel tempo, non è stata però accompagnata da differenziazione in podociti e produzione di nuovo collagene, escludendo quindi che il maggiore numero di podociti sia dovuto a proliferazione e differenziazione delle cellule amniotiche. Dati ottenuti tramite esperimenti in vitro confermano l’effetto positivo delle AFSC nella risposta delle cellule del glomerulo all’Angiotensina II , tramite diminuzione nell’espressione del suo recettore di tipo 1 (ANGTR1), esercitando un effetto benefico di protezione delle cellule del golomerulo, in particolare dei podociti. Contemporaneamente, una significativa variazione nel profilo immunostimolatorio è stata rilevata negli animali trattati, che presentavano una diminuzione significativa nell’espressione di molecole quali TNF-a, CCL, CXCL2 e M-CSF, coinvolte nella stimolazione di macrofagi di fenotipo M1, noti per la loro azione pro-fibrotica e pro-infiammatoria. Per concludere, le cellule staminali da liquido amniotico sono capaci di rallentare la progressione della Sindrome di Alport tramite mantenimento del numero di podociti, attivazione di macrofagi M2c pro-rigenerativi a discapito dei pro-fibrotici M1 e modulazione endocrina/paracrina dei segnali cellulari all’interno del rene; favorendo il mantenimento strutturale e funzionale del tessuto renale.