Generation and characterization of a new model of OPA1-linked Dominant Optic Atrophy

Mitochondria are very dynamic organelles with a crucial role in life and death of eukaryotic cells. These organelles regulate cellular energy generation, calcium and redox homeostasis, and apoptosis. To perform the cellular functions effectively, mitochondria continuously change their structure and morphology through protein machineries controlling fission and fusion process (mitochondrial dynamics). Strong evidence has emerged to implicate disturbed mitochondrial fusion and fission as central pathological components underpinning a number of childhood and adult-onset neurodegenerative disorders. Several proteins that regulate the morphology of the mitochondrial network have been identified, the most widely studied of which are Optic Atrophy 1 (OPA1), Mitofusin1 and 2 (Mfn1 and 2) and Dynamin Related Protein 1 (DRP1). OPA1 is a ubiquitously expressed dynamin-like GTPase in the inner mitochondrial membrane. It plays important roles in mitochondrial fusion, apoptosis, reactive oxygen species (ROS) and ATP production. Mutations of OPA1 result in autosomal Dominant Optic Atrophy (DOA), a common hereditary optic neuropathy characterized by retinal ganglion cell degeneration leading to optic neuropathy, symmetrical central visual loss and dyschromatopsia. The majority of OPA1 mutations result in premature termination codons, and the resultant truncated mRNA species are highly unstable, being rapidly degraded by protective surveillance mechanisms operating via nonsense-mediated mRNA decay. Haploinsufficiency, therefore, is a major disease mechanism in DOA, and the pathological consequences of a dramatic reduction in OPA1 protein levels is highlighted by those rare families who are heterozygous for microdeletions spanning the entire OPA1 coding region. Progressive visual failure remains the defining feature of DOA but, with greater availability of genetic testing, a specific OPA1 mutation in exon 14 (c.1334G>A, p.Arg445His) has been found to cause sensorineural deafness, ataxia, myopathy, peripheral neuropathy, and classical chronic progressive external ophthalmoplegia. This syndrome is called DOA plus. The molecular mechanisms linking OPA1 mutations and DOA are not fully understood. In this work a new model of OPA1-linked Dominant Optic Atrophy was generated in Drosophila melanogaster, in order to use it for studying DOA pathogenesis. The Drosophila OPA1 gene (dOPA1) shares 51.2% similarity with its human orthologue and the alignment of protein sequence of hOPA1 with dOPA1 shows that the domains most subjected to pathogenic mutations are well conserved. To address the pathophysiological mechanism of OPA1-linked DOA, we generated two dOPA1 mutants: OPA1 R417H, a mutant that carries in endogenous dOPA1 the mutation corresponding to R445H in humans; OPA1null carrying a microdeletion leading to production of a inactive truncated protein of 482 amino acids. To model these mutations we have used in vivo CRISPR/Cas9, a genome engineering system that has revolutionized genetic analysis in many organisms. For use in genome engineering the system requires two essential components: gRNA and Cas9-endonuclease. The gRNA recognizes a 20-nt target sequence next to a trinucleotide NGG protospacer adjacent motif (PAM) to direct Cas9-dependent cleavage of both DNA strands within the target sequence. Several groups have used the CRISPR/Cas9 system to induce targeted mutations in Drosophila, but differ in their approach to supply the Cas9 protein and gRNA components of the system. It has been demonstrated that two targeting gRNAs can be used to generated a large defined deletions and the Cas9 catalyzed gene replacement by homologous recombination. The experimental design of my work requires the following steps: generation of the gRNAs responsible for precisely targeting the genomic region where recombination should take place; generation of the dsDNA templates containing the desired genomic modifications to be introduced and homology arms for accurate recombination; choice of a screening method. The gRNAs guide the cut of the Cas9 on the genomic region of the dOPA1 gene through the target sequences and the PAM sites; the cut of genomic DNA favors homologous recombination with the dOPA1 mutated fragment cloned into dsDNA plasmid donor. The exogenous dOPA1 mutated gene in addition to the pathological mutations carries a silent mutation that introduces a novel BamHI restriction site necessary for screening the occurrence of homologous recombination events by restriction digest. The gRNAs and the dsDNA plasmids donors were microinjected in the embryo of the Drosophila line expressing Cas9 protein in the ovary under control of vasa regulatory sequences. The mutants were screened for the presence of the mutation through PCR on genomic DNA, restriction digest and sequencing of the OPA1 mutated fragment. After having verified that the mutants had mutations of interest without any other alterations, we described the phenotypic effects observed in these mutants. We also analyzed the mitochondria in the nervous and muscular systems using confocal microscopy and the mitochondrial functions through biochemical assays. Observations of the adults within the lines shows that both mutations in heterozygosity do not cause any evident morphological alterations. However, both mutations in homozygosity turned out to be lethal but differently R417H homozygous mutants develop until the second instar larva stage whereas the OPA1null homozygotes die earlier at the first instar larva stage. We were more interested in studying the heterozygote dOPA1 mutants because DOA is a dominant disease. The lifespan reduction of both dOPA1 mutants indicate that the heterozygous mutations of OPA1 is likely to cause systemic consequences probably affecting multiple processes. Since OPA1 is involved in mitochondrial dynamics we performed a series of experiments to analyze mitochondrial morphology in the neuronal and muscular systems of both dOPA1 mutants. Heterozygous dOPA1 mutants display defects of mitochondria morphology in nerves and muscles in Drosophila third instar larvae, mitochondria network shape is characterized by mild fragmentation and clusterization. Mitochondria function was analyzed on homozygous and heterozygous dOPA1 mutants. Mitochondrial respiration and the redox activity of respiratory complexes was decreased in both mutants. Furthermore heterozygous OPA1 R417H displayed more severe effects in some assays than OPA1null heterozygotes. This suggested that R417H mutation could interfere with the activity of the wild type copy of dOPA1 resulting in more severe phenotypes than those caused by the presence of a single loss of function allele. In conclusion, we have produced a model to study the Dominant Optic Atrophy which can be helpful to understand the pathogenesis of this disease caused by different classes of mutations within the OPA1 gene.

I mitocondri sono organelli dinamici fondamentali per la vita e la morte delle cellule eucariotiche, svolgono diverse funzioni tra cui: produzione di ATP, regolazione dell’omeostasi del Ca2+, produzione di ROS e regolazione dell’apoptosi. I processi di fusione e fissione mitocondriale (dinamiche mitocondriali) sono alla base del corretto funzionamento di questi organelli e sono controllati da una serie di proteine che, di conseguenza, regolano forma e struttura dei mitocondri. Disturbi delle dinamiche mitocondriali sono alla base di diverse patologie neurodegenerative che colpiscono bambini e giovani adulti. Le diverse proteine che regolano la morfologia della network mitocondriale sono state individuate in vari studi, le principali sono: Optic Atrophy 1 (OPA1), Mitofusin1 and 2 (Mfn1 and 2) and Dynamin Related Protein 1 (DRP1). OPA1 è una proteina ubiquitaria della famiglia delle dianamine, con attività GTPasica, situata sulla membrana interna dei mitocondri. Presenta un ruolo fondamentale nel processo di fusione mitocondriale, apoptosi, produzione di ROS e produzione di ATP. Mutazioni di OPA1 sono alla base dell’ Atrofia Ottica Dominante (DOA), una comune neuropatia ottica ereditaria caratterizzata da degenerazione delle cellule ganglionari della retina con conseguente neuropatia, perdita della capacità visiva simmetrica centrale e discromatopsia. La maggior parte delle mutazioni patologiche di OPA1 determinano la formazione di codoni di stop, con conseguente produzione di forme troncate di mRNA altamente instabili che vengono rapidamente degradate dai vari meccanismi di controllo. L’aploinsufficienza è il principale meccanismo patogenetico della DOA, le conseguenze di una drastica riduzione dei livelli di OPA1 sono ben visibili in famiglie in cui sono state identificate microdelezioni in eterozigosi, localizzate nella regione codificante del gene di OPA1. La perdita progressiva della vista rimane la caratteristica principale della DOA ma, la maggior disponibilità di test genetici, ha permesso di identificare una mutazione specifica del gene OPA1 localizzata sull’esone 14 (c.1334G>A, p.Arg445His) che causa DOA, associa a sordità neurosensoriale, atassia, miopatia, neuropatia periferica e oftalmoplegia esterna progressiva cronica. Questa sindrome è chiamata DOA plus. I meccanismi molecolari alla base di DOA causata da mutazioni di OPA1 non sono del tutto chiari. In questo lavoro abbiamo generato un nuovo modello di Atrofia Ottica Dominante usando Drosophila melanogaster, al fine di utilizzarlo per studiare e comprendere al meglio la patogenesi di questa malattia. Il gene OPA1 di Drosophila (dOPA1) mostra il 51.2% di similarità con il gene ortologo umano, l’allineamento della proteina umana con quella di Drosophila mostra che i domini, su cui si localizzano la maggior parte delle mutazioni patologiche, sono altamente conservati. Per studiare il meccanismo patofisiologico della DOA dovuta a mutazioni di OPA1, abbiamo generato due mutanti dOPA1: OPA1 R417H, un mutante che porta la mutazione corrispondente alla mutazione umana OPA1 R445H; e il mutante OPA1null in cui è stata inserita una microdelezione che determina la produzione di una forma tronca inattiva di 482 aminoacidi. Per inserire queste mutazione nel genoma di Drosophila abbiamo utilizzato il sistema CRISPR/Cas9, un sistema che permette la modifica del DNA genomico e che ha rivoluzionato le analisi genetiche in diversi organismi. Le componenti fondamentali di questo sistema sono gRNA e endonucleasi Cas9. Il gRNA riconosce una sequenza target di 20nt seguita da un sito PAM (protospacer adjacent motif), costituito da tre nucleotidi NGG, e necessario per indirizzare il taglio dei due filamenti del DNA genomico ad opera dell’endonucleasi Cas9. Diversi gruppi di ricercatori hanno utilizzato il sistema CRISPR/Cas9 per introdurre specifiche mutazioni nel genoma di Drosophila, mettendo a punto vari metodi di somministrazione delle diverse componenti. È stato dimostrato che un approccio metodologico efficace, è l’utilizzo di una coppia di gRNA che, mediante il taglio del Ca9, determinano una larga delezione in una porzione genomica ben definita e questo, in presenza di una dsDNA donatore, favorisce la sostituzione genica mediante ricombinazione omologa. Il disegno sperimentale del mio lavoro richiede i seguenti steps: generazione dei gRNA in grado di indirizzare il taglio dell’endonucleasi sulla regione genomica di interesse; generazione del dsDNA donatore contenete la porzione genica con le mutazioni desiderate e due regioni di omologia limitrofe ad essa e necessarie per la corretta ricombinazione e infine la scelta di un metodo di screening. I gRNA guidano il taglio del Cas9 sulla porzione genomica del gene dOPA1 grazie alla sequenza target di 20nt e ai siti PAM; il taglio del DNA genomico favorisce la ricombinazione omologa con il frammento mutato di dOPA1 clonato nel plasmide dsDNA donatore. Sul frammento genico esogeno, oltre alla mutazione patologica di OPA1, è stata inserita una mutazione silente per introdurre un sito di restrizione dell’enzima BamHI, necessario per lo screening dei mutanti in cui è avvenuta la corretta ricombinazione. I gRNAs e i plasmidi dsDNA donatori sono stati microiniettati in embrioni di una linea di Drosophila in cui la proteina Cas9 è espressa nelle cellule germinali, sotto il controllo del fattore di regolazione della trascrizione genica, vasa. Lo screening per individuare i mutanti corretti è stato fatto mediante PCR sul DNA genomico, taglio di restrizione e sequenziamento. Dopo aver verificato la corretta ricombinazione omologa del frammento esogeno abbiamo eseguito una caratterizzazione fenotipica dei mutanti. Mediante microscopia confocale, abbiamo analizzato la morfologia dei mitocondri nel sistema nervoso e muscolare; con dei saggi biochimici abbiamo poi testato la funzionalità mitocondriale in larve mutanti. Gli adulti eterozigoti per le mutazioni di dOPA1 non presentano evidenti alterazioni morfologiche. Entrambe le mutazioni però, risultano letali in omozigosi ma con delle differenze: la mutazione R417H risulta essere letale al secondo stadio larvale mentre la completa assenza di OPA1, che si determina nel mutante omozigote OPA1null, è letale al primo stadio larvale. Essendo DOA una malattia genetica dominante, è importante studiare gli effetti di queste mutazioni sui mutanti eterozigoti. Analizzando la durata media della vita dei mutanti adulti eterozigoti, abbiamo osservato un importante riduzione di questo parametro, simile per entrambe le mutazioni e collegato probabilmente agli effetti sistemici che si hanno in seguito all’alterazione di vari processi cellulari che coinvolgono OPA1 e i mitocondri. Dato che OPA1 è una proteina coinvolta nella regolazione delle dinamiche mitocondriali, abbiamo messo a punto una serie di esperimenti per analizzare la morfologia mitocondriale nel sistema nervoso e muscolare dei mutanti dOPA1. In larve terzo stadio eterozigoti per entrambe le mutazioni abbiamo osservato alterazioni della morfologia mitocondriale in nervi e muscoli, il network mitocondriale è caratterizzato da lieve frammentazione e presenza di cluster. La funzionalità mitocondriale è stata analizzata nei mutanti dOPA1 eterozigoti ed omozigoti. Respirazione mitocondriale e attività redox dei complessi della catena respiratoria risultano ridotte in entrambi i mutanti. Inoltre, il mutante OPA1 R417H eterozigote risulta avere deficit di funzionalità mitocondriale maggiore rispetto al mutante OPA1null eterozigote. Questo suggerisce che la mutazione R417H possa interferire con l’attività della copia wild type di dOPA1, determinando un fenotipo più grave della perdita di un solo allele funzionante. Per concludere, possiamo affermare di aver prodotto un modello di Atrofia Ottica Dominate che potrebbe essere d’aiuto per lo studio della patogenesi di questa malattia e per comprendere meglio come agiscono le diverse classi di mutazioni sul gene OPA1