GENERATION AND CHARACTERIZATION OF STREPTOCOCCUS PYOGENES STREPTOLYSIN O DERIVATIVES AS VACCINE CANDIDATES

Streptococcus pyogenes or Group A Streptococcus (GAS) is a human pathogen which colonizes the throat and the skin causing non-invasive diseases, as pharyngitis or impetigo, as well as more invasive and life-threatening pathologies, as pneumonia, necrotizing fascitiis or streptococcal toxic shock syndrome (STSS), in addition to non-suppurative sequels, as rheumatic fever or glomerulonephritis. GAS is sensible to penicillins and other antibiotics, but during the last years the increasing appearance of multiple antibiotic resistance strains prompted the research towards the development of an effective vaccine. One of the most important GAS virulence factors is Streptolysin O and the determination of the antibodies levels against this antigen is routinely used as a marker of recent GAS infections (ASO titre). Streptolysin O belongs to the Cholesterol Depending Cytolysins (CDCs) family, a group of Gram positive secreted toxins which induce cell lysis through pores formation. SLO exerts many additional toxic effects, for instance: i) promoting cytokines and other pro-inflammatory molecules release, ii) interfering with the complement pathway system activation, iii) translocating additional GAS virulence factors (i.e. NAD glycohydrolase) into eukaryotic cells, iv) causing platelets and polymorphonucleated lymphocytes (PMNL) aggregation in vivo. Additionally, SLO intravenous injection has been shown to be lethal in several animal models. We have previously demonstrated that mice immunized with a recombinant form of Streptolysin O (rSLOwt) are protected against intranasal (i.n.) infection with GAS M1 3348 strain (provided by Istituto Superiore di Sanità, Roma). Yet, due to its toxic effects, the possible inclusion of SLO in a vaccine formulation is not recommended. Therefore, we generated genetic mutants showing a lower toxic profile, both in vitro and in vivo, when compared to the wild type rSLO. In particular, a double mutant derivative (rSLOdm) was chosen for more detailed studies, showing that both, cell binding to eukaryotic cells and oligomerization into the cell membranes, were highly impaired in the mutant with respect to the wild type counterpart. We also demonstrated that rSLOdm could still induce antibodies which neutralized rSLOwt toxicity in vitro and that mice immunized with rSLOdm were protected against i.n. challenge with GAS M1 3348 strain and intravenous (i.v.) injection of the rSLOwt toxin. On the basis of our results, the inclusion of this detoxified form of SLO in a human anti-GAS vaccine formulation may be considered in order to elicit an effective protective immune response against Streptococcus pyogenes infections.

Streptococcus pyogenes o Streptococco di Gruppo A (GAS) è un patogeno prettamente umano che colonizza la gola e la pelle causando patologie non invasive, come faringiti o impetigine, ma anche patologie più severe, come polmoniti, meningiti, fasciti necrotizzanti, e sequelae non suppurative, generalmente associate a fenomeni autoimmuni, come la febbre reumatica o il deposito a livello renale di immunocomplessi con conseguenti glomerulo-nefriti. Uno dei fattori di virulenza più importanti e conosciuti di GAS è la streptolisina O (SLO) il cui titolo (titolo ASO) nell’uomo viene generalmente utilizzato come marker di recenti infezioni da Streptococcus pyogenes. Questa tossina fa parte della famiglia delle Cholesterol Depending Cytolysins (CDCs), un gruppo di proteine secrete da batteri Gram positivi che, legando il colesterolo sulle cellule eucariotiche, inducono lisi attraverso la formazione di pori. SLO presenta anche altri effetti tossici, tra cui le capacità di: i) favorire il rilascio di citochine, ii) attivare il complemento, iii) traslocare un altro fattore di virulenza secreto da GAS (la NADasi) dentro cellule target, iv) causare, in vivo, la formazione di aggregati piastrine/linfociti polimorfonucleati (PMNL), probabilmente alla base di una sindrome conosciuta come shock tossico streptococcico (STSS) dall’esito così fulmineo che causa ancora oggi la morte nel 30% dei soggetti colpiti. Inoltre è stato dimostrato che animali da laboratorio trattati endovena con pochi microgrammi della tossina muoiono in breve tempo dopo l’inoculo. All’interno del progetto di ricerca Novartis per un vaccino contro GAS, è stato dimostrato che topi immunizzati con una forma ricombinante di SLO (rSLOwt) sopravvivono (90% di protezione) ad una successiva infezione per via intranasale con una dose letale del ceppo M1 3348 (appartenente alla collezione dell’Istituto Superiore di Sanità – ISS). A causa dei suoi effetti tossici, non è però possibile inserire la proteina nella sua versione wild type in un vaccino per utilizzo umano. Per questo motivo, lo scopo di questo lavoro è stato quello di generare dei mutanti genetici con ridotto profilo tossico che mantenessero, però, le capacità protettive della proteina wild type. In particolare, abbiamo generato un doppio mutante (rSLOdm) che presenta una ridotta abilità, rispetto a rSLOwt, nell’indurre emolisi di cellule eucariotiche sia perché la sua capacità di legare le cellule è ridotta sia perché, una volta legato, non è in grado di formare oligomeri attivi. rSLOdm è inoltre meno tossico, in vivo, della proteina wild type, come mostrato in un modello murino di iniezione endovena. Abbiamo infine dimostrato, in vitro ed in vivo, che il doppio mutante induce anticorpi in grado di inibire l’attività emolitica di rSLOwt e che topi immunizzati con questa forma detossificata sono protetti sia contro un iniezione endovena di una dose letale di rSLOwt sia contro un’infezione intranasale con il ceppo M1 3348. Sulla base dei nostri risultati è quindi possibile prendere in considerazione l’inclusione di questa forma detossificata di SLO in un vaccino per GAS ad uso umano per favorire la generazione di una risposta immunitaria protettiva.