In vitro and in vivo study of NETosis in diabetic wound healing

People with diabetes have an increased risk of developing several serious health problems. One of the most frequent complication is an impaired wound healing. Neutrophils are recruited early to the wound bed and, upon activation, they undergo histone citrullination by protein arginine deiminase (PAD)4, exocytosis of chromatin and enzymes as neutrophil extracellular traps (NETs), and death. This process is called NETosis. In diabetes, neutrophils are primed to release NETs and die by NETosis. Although this process is a defense against infection, excessive NETosis can damage tissue. The aim of this study was to examine the effect of NETosis on the healing of diabetic foot ulcers (DFUs). Using proteomics, we found that NET components were enriched in non-healing human DFUs. In an independent validation cohort, a high concentration of neutrophil elastase in the wound was associated with infection and a subsequent worsening of the ulcer. NET components were elevated in the blood of patients with DFUs. Neutrophils isolated from the blood of DFU patients showed an increased spontaneous NETosis, but an impaired inducible NETosis. We have set up a system of intravital microscopy to monitor the presence of neutrophils in a mouse model of ulcer; this imaging technique, in addition to FACS detection of histone citrullination, showed that (1) PAD4 activity was increased by diabetes and (2) NETosis occurred in the bed of excisional wounds. PAD4 inhibition by Cl-amidine reduced NETting neutrophils and rescued wound healing in diabetic mice. Cumulatively, these data suggest that NETosis delays DFU healing and its modulation could be a therapeutic strategy to improve outcome of DFU in diabetic patients.

La FID, Federazione Internazionale del Diabete, paragona questa patologia ad una vera e propria epidemia inarrestabile. Una delle gravi complicanze causata da questa malattia sono le ulcere nel piede del diabetico (DFU, Diabetic Foot Ulcer): infatti la guarigione delle ferite è compromessa in molti pazienti diabetici e ciò provoca un aumentato rischio di morbilità e mortalità. I neutrofili sono le principali cellule coinvolte nelle prime fasi della guarigione delle ulcere, in quanto sono la principale componente cellulare reclutata in sede di danno tissutale. I neutrofili hanno un ruolo fondamentale nel sistema immunitario innato e rappresentano la prima difesa contro l’infezione da patogeni. Questa attività antimicrobica è resa possibile anche da un tipo di morte cellulare tipico dei neutrofili al quale è stato dato il nome di NETosi. La NETosi si differenzia da necrosi, apoptosi, necroptosi e autofagia. E’ innescata da PAD4 (Peptidil Arginine Deaminase 4) che è un enzima nucleare Ca2+-dipendente appartenente alla superfamiglia delle amidinotransferasi, coinvolto nella citrullinazione degli istoni. A questa fase seguono la decondensazione della cromatina, la migrazione dell’elastasi all’interno del nucleo e la rottura della membrana nucleare con il conseguente rilascio di DNA sottoforma di filamenti. Questi filamenti, chiamati NETs (Neutrophil Extracellular Traps), sono composti da enzimi e proteine granulari e da materiale nucleare, il cui compito è quello di intrappolare fisicamente i patogeni e le loro componenti, fino alla lisi cellulare. Questo processo è alterato nel diabete e può provocare danni ai tessuti, causando un ritardo nella guarigione delle ferite. Lo scopo di questo progetto è stato quello di studiare gli effetti della NETosi sulla guarigione delle ulcere dei pazienti diabetici, avvalendoci anche dell’uso di un modello sperimentale animale. L’analisi proteomica iniziale ci ha permesso di identificare le proteine coinvolte in questo processo; inoltre, abbiamo osservato che nel sangue dei pazienti diabetici vi è una sovra-espressione di alcuni di questi componenti. I neutrofili isolati da questi pazienti mostrano: 1- un incremento della NETosi spontanea; 2- un’alterata NETosi indotta; 3- un’aumentata attività dell’enzima PAD4. Per studiare meglio questo processo abbiamo messo a punto una tecnica di imaging intravitale nell’ulcera di modello murino, che parallelamente all’analisi citofluorimetrica degli istoni citrullinati, ha messo in risalto il coinvolgimento della NETosi nel processo di guarigione delle ulcere diabetiche. Inoltre l’inibizione di PAD4 nel topo, ha dato evidenze sperimentali di un miglioramento nella guarigione delle ulcere. In futuro questo protocollo sperimentale potrebbe essere utilizzato come strategia terapeutica di modulazione della NETosi per migliorare le DFU nei pazienti diabetici.