Structural analysis of SulP/SLC26 anion transporters

The subject of this thesis is a family of anion transporters known as SulP/SLC26 (Sulfate Permease/Solute Carrier 26) family, a large and ubiquitous family of membrane proteins capable of transporting a wide variety of monovalent and divalent anions, whose members were found in eubacteria, plants, fungi, and mammals. The clinical relevance of the SulP/SLC26 gene family has been highlighted with the identification of pathogenic mutations related to hereditary genetic human diseases with diverse symptoms that arise as a result of the different substrate specificities and tissue localizations of the different transporters, such as dystrophic dysplasia (SLC26A2), congenital chloride diarrhoea (SLC26A3) and Pendred syndrome (SLC26A4). The SulP/SLC26 family belongs to the APC (Amino Acid-Polyamine-Organocation) superfamily, one of the largest superfamily of secondary carriers. While some members of other families of the APC superfamily have been structurally characterized, very little is known about the molecular organization of the SulP/SLC26 proteins and no high-resolution three-dimensional structure of full-length sequences is available. The SulP/SLC26 anion transporters share a common structural organization: a highly conserved transmembrane domain and a less conserved cytoplasmic C-terminal portion mainly composed of a STAS domain. The name STAS (Sulfate Transporter and Anti-Sigma factor antagonist) is due to a remote but statistically significant sequence similarity with bacterial ASA (Anti-Sigma factor Antagonist) proteins (Aravind and Koonin, 2000). The bacterial ASA proteins are functionally and structurally well characterized in their 3D structure both by NMR spectroscopy and X-ray crystallography. Unlike these proteins, the STAS domains present in anion transporters are poorly characterized in terms of both their function and structure. Despite the fact that their precise role is unclear, the STAS domains play a fundamental role in the function/regulation of SulP/SLC26 anion transporters. In particular, it has been proposed that the STAS domain, like ASA proteins, could have a role in protein/protein interaction; for instance the STAS domains of SCL26A3, -A4, -A6 and -A9 interact with the R domain of CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), the transmembrane protein involved in cystic fibrosis disease. So far three 3D structures of STAS domains from different species are available in literature, two from bacteria and one from mammalian, the latter solved during my Master Degree Thesis in the same laboratory where I've attended the PhD. The structural characterization of the full-length SulP/SLC26 transporters and of their STAS domains is fundamental for the comprehension of their mode of action and it is an essential step for the understanding of the functional consequences of the mutations responsible for related pathologies. To address this issue, one part of my PhD project focused on the production and the structural characterization of STAS domains from different species, and mutants of the STAS domain whose 3D structure have been solved, in order to study the anion-binding site and the possible role of the STAS domain in the transport. We identified a fundamental residue for the proper function of the transporter, probably implicated in the anion translocation within the transmembrane domain. The other part of the project dealt with the production of a selection of full-length SulP/SLC26 transporters from different orthologs, both Prokaryotes and Eukaryotes. To this aim, in collaboration with Prof. Frank Bernhard at the Johann Wolfgang Goethe University of Frankfurt (Germany), I used the cell-free (CF) expression method, an emerging technique for the large-scale production of membrane proteins for structural studies. Sample properties after post-translational solubilization have been analyzed by evaluation of homogeneity and protein stability. This is the first quality evaluation of the SulP/SLC26 transporters produced by CF expression mode in quantities appropriate for structural approaches.

Il soggetto di questa tesi è una famiglia di trasportatori di anioni nota come famiglia SulP/SLC26 (Sulfate Permease/Solute Carrier 26), una grande ed ubiquitaria famiglia di proteine di membrana in grado di trasportare un'ampia varietà di anioni monovalenti e divalenti, i cui membri sono stati trovati in eubatteri, piante, funghi, e mammiferi. La rilevanza clinica della famiglia genica SulP/SLC26 è stata evidenziata dall'identificazione di mutazioni patogene connesse a malattie umane genetiche ed ereditarie, con diversi sintomi che sorgono come risultato delle differenti specificità di substrato e localizzazioni tissutali dei differenti trasportatori, come la displasia distrofica (SLC26A2), la diarrea cloridrica congenita (SLC26A3) e la sindrome di Pendred (SLC26A4). La famiglia SulP/SLC26 appartiene alla superfamiglia APC (Amino Acid-Polyamine-Organocation), una delle più grandi superfamiglie di trasportatori secondari. Mentre alcuni membri di altre famiglie della superfamiglia APC sono stati caratterizzati strutturalmente, si sa molto poco riguardo l'organizzazione molecolare delle proteine SulP/SLC26 e non è disponibile nessuna struttura tridimensionale ad elevata risoluzione delle intere sequenze. I trasportatori di anioni SulP/SLC26 condividono un'organizzazione strutturale simile: un dominio transmembrana altamente conservato ed una porzione C-terminale meno conservata principalmente composta da un dominio STAS. Il nome STAS (Sulfate Transporter and Anti-Sigma factor antagonist) è dovuto ad una similarità di sequenza remota ma statisticamente significativa con le proteine batteriche ASA (Anti-Sigma factor Antagonist) (Aravind and Koonin, 2000). Le proteine batteriche ASA sono state ben caratterizzate funzionalmente e strutturalmente nella loro struttura 3D sia mediante la spettroscopia NMR sia mediante cristallografia a raggi X. A differenza di queste proteine, i domini STAS presenti nei trasportatori di anioni sono stati poco caratterizzati sia in termini della loro funzione, sia della loro struttura. Nonostante il fatto che il loro preciso ruolo non sia chiaro, i domini STAS svolgono un ruolo fondamentale nella funzione/regolazione dei trasportatori di anioni SulP/SLC26. In particolare, è stato proposto che il dominio STAS, come le proteine ASA, potesse svolgere un ruolo nell'interazione proteina/proteina; per esempio, domini STAS di SCL26A3, -A4, -A6 e -A9 interagiscono con il dominio R di CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), la proteina transmembrana coinvolta nella fibrosi cistica. Finora tre strutture 3D di domini STAS provenienti da specie diverse sono disponibili in letteratura, due da batteri ed una da mammifero, quest'ultima risolta durante la mia tesi di laurea specialistica nello stesso laboratorio dove ho frequentato il dottorato. La caratterizzazione strutturale degli interi trasportatori SulP/SLC26 e dei loro domini STAS è fondamentale per la comprensione del loro modo di azione ed è una fase essenziale per comprendere le conseguenze funzionali delle mutazioni responsabili delle patologie collegate. Per raggiungere questo obiettivo, una parte del mio progetto di dottorato si è focalizzata sulla produzione e caratterizzazione strutturale dei domini STAS provenienti da diverse specie, e mutanti del dominio STAS la cui struttura 3D è stata risolta per studiare il sito di legame dell'anione ed il possibile ruolo del dominio STAS nel trasporto. È stato identificato un residuo fondamentale per il corretto funzionamento del trasportatore, probabilmente implicato nella traslocazione dell'anione all'interno del dominio transmembrana. L'altra parte del progetto riguarda la produzione di una selezione di trasportatori SulP/SLC26 interi provenienti da diversi ortologhi, sia Procarioti che Eucarioti. Per questo scopo, in collaborazione con il Prof. Frank Bernhard presso l'università Johann Wolfgang Goethe di Francoforte (Germania), utilizzai il metodo di espressione cell-free (CF), una tecnica emergente per la produzione a larga scala di proteine di membrana per studi strutturali. Le proprietà dei campioni dopo la solubilizzazione post-traduzionale sono state analizzate mediante la valutazione di omogeneità e della stabilità della proteina. Questa è la prima valutazione della qualità dei trasportatori SulP/SLC26 prodotti mediante il modo di espressione CF in quantità appropriate per approcci strutturali.