Relationship between AOPP (Advanced Oxidation Protein Products) and bovine neutrophils "in vitro": AOPP production by neutrophils and AOPP effects on neutrophils ROS production and viability

The aim of the present study was to evaluate the relationship between AOPP (Advanced oxidation protein products) and bovine neutrophils 'in vitro'. For this purpose AOPP were produced "in vitro" by oxidizing bovine serum albumin with HOCl (hypochlorous acid) and bovine neutrophils were isolated from whole blood of dairy cattles. AOPP-BSA were incubated with freshly isolated bovine neutrophils, unstimulated and stimulated with PMA a strong activator of the respiratory burst. Neutrophils ROS production and viability were measured by luminol-amplified chemiluminescence and by MTT and lactate dehydrogenase assays (LDH), respectively. Results obtained have shown that AOPP-BSA are able to reduce significantly ROS production of PMA stimulated neutrophil and their viability measured by MTT assay, no cell lysis was detected by LDH assay. On the basis of these results, our work has studied if AOPP are able to trigger apoptotic events. For this purpose, caspase 8-9-3 and DNA laddering were used as markers in order to discriminate between the 'intrinsic' and the 'extrinsic' pathway of apoptosis. The results obtained showed that un-stimulated bovine neutrophils incubated with AOPP-BSA show a higher but not significant production of active caspase 8 in comparison with the incubation with BSA. Also caspase 3 display an increase, but not significant, in un-stimulated neutrophils after 6 hours of incubation with AOPP-BSA, respects the incubation with BSA. No differences were obtained for caspase 9 and for DNA laddering. Therefore, in these experimental conditions is possible to conclude that the 'intrinsic' pathway of apoptosis was not involved in the reduced functionality of neutrophils or in their reduced viability, but bovine neutrophils incubated with AOPP-BSA seem to be "accompanied" to the early phases of the 'extrinsic' pathways of apoptosis. In addition, the present work wanted to evaluate the capacity of triggered neutrophils to generate AOPP in vitro. BSA was incubated with un-stimulated and PMA-stimulated bovine neutrophils for 1-2-3 hours and the production of specific markers of protein oxidation such as AOPP, dityrosines and carbonyls was assessed. BSA incubated with stimulated neutrophils presents a significant higher level of AOPP and dityrosines respects the incubation with un-stimulated neutrophils. Carbonyls don't seem to be produced in these condition, at least at the beginning of the incubation. In parallel, BSA incubated with the same concentration of HOCl produced by PMA-stimulated neutrophils, for 1-2-3 hours, presents a higher level of AOPP, dityrosines and carbonyls. Therefore, it's possible to conclude that bovine neutrophils are able to oxidize BSA in vitro and generate chemical and structural modification such as AOPP and dityrosines, in the experimental condition used. However, carbonyls seem to be a non-specific indicator of neutrophils-mediated protein oxidation. The direct exposure of BSA to HOCl couldn't fully mimic the complex events leading to BSA oxidation and AOPP production by activated neutrophils.

Lo scopo del presente studio è stato quello di valutare le relazioni tra AOPP (prodotti avanzati di ossidazione proteica) e i neutrofili di bovino "in vitro". A questo scopo le AOPP sono state generate "in vitro", ossidando l'albumina sierica bovina con HOCl (acido ipocloroso) mentre i neutrofili di bovino sono stati isolati da sangue intero di bovine da latte. Le AOPP-BSA sono state incubate con i neutrofili di bovino appena isolati in condizioni di assenza di stimolo o stimolati con PMA un forte attivatore del "burst" respiratorio. La produzione di ROS da parte dei neutrofili e la loro vitalità , sono state misurate rispettivamente mediante chemiluminescenza amplificata dal luminolo e dai saggi MTT e lattato deidrogenasi (LDH). I risultati ottenuti hanno mostrato che le AOPP-BSA sono in grado di ridurre significativamente la produzione di ROS da parte dei neutrofili stimolati con PMA e la loro vitalità , misurata con il saggio MTT mentre non è stata rilevata lisi cellulare mediante saggio LDH. Sulla base di questi risultati il presente lavoro si è proposto di studiare se le AOPP sono in grado di scatenare eventi apopotici. A questo scopo le caspasi 3, 8 , 9 e la frammentazione del DNA sono stati utilizzati come marker con l'obiettivo di discriminare tra la via intrinseca e quella estrinseca di apoptosi. I risultati ottenuti hanno mostrato che i neutrofili di bovino non stimolati e incubati con AOPP-BSA per 1 ora e 6 ore, presentano una maggiore ma non significativa produzione di caspasi 8 attiva, se comparati con l'incubazione con BSA. Anche la caspasi 3 mosta un incremento, non significativo in neutrofili non stimolati incubati con AOPP-BSA per 6 ore, rispetto all'incubazione con BSA. Non è stata ottenuta alcuna differenza per quanto riguarda la caspasi 9 e la frammentazione del DNA. Tuttavia, in queste condizioni sperimentali è possibile concludere che la via intrinseca dell'apoptosi non è coinvolta nella riduszione della funzionalità  dei neutrofili di bovino o nella loro vitalità  ma i neutrofili di bovino incubati con AOPP-BSA sembrano piuttosto essere 'accompagnati' verso le fasi precoci della via estrinseca dell'apoptosi. Inoltre, il seguente studio ha voluto valutare la capacità  dei neutrofili di bovino attivati di generare AOPP 'in vitro'. La BSA è stata incubata con neutrofili di bovino non stimolati e stimolati con PMA per 1-2-3 ore, ed è stata misurata la formazione di specifici marcatori di ossidazione proteica come le AOPP le ditirosine e i carbonili. La BSA incubata con neutrofili stimolati con PMA, presenta un livello significativamente alto di AOPP e ditirosine rispetto all'incubazione con neutrofili non stimolati. I carbonili invece sembrano non essere prodotti in queste condizioni, almeno nelle fasi inziali dell'incubazione. In parallelo, la BSA incubata con la stessa concentrazione di HOCl prodotta dai neutrofili stimolati, per 1-2-3 ore, presenta livelli più elevato di AOPP, ditirosine e carbonili. Tuttavia è possibile concludere che i neutrofili di bovino sono in grado di ossidare la BSA e generare modificazioni chimiche e strutturali come AOPP e ditirosine nelle condizioni sperimentate. I carbonili invece sembrano non essere un marcatore specifico di ossidazione proteica mediata dai neutrofili. In aggiunta la diretta esposizione della BSA all'HOCl non è in grado di mimare completamente la complessità  degli eventi che portano all'ossidazione della BSA e alla produzione di AOPP da parte dei neutrofili attivati.