Impact of S.pneumoniae type-I pilus and its subunits on bacterial adherence to human epithelial cells

S. pneumoniae is a human pathogen able to cause both invasive and non-invasive diseases as well as to colonize the nasopharyngeal tract of children and adults. Despite pneumococcus is a leading cause of morbidity and mortality worldwide, the pathogenic mechanisms exploited by S. pneumoniae are not yet clear. A critical step is colonization of the nasopharynx and the initial interaction of pneumococci with host cells. Recently, pili were discovered in gram-positive bacteria, mediating critical host-bacterial interactions, such as adherence to the epithelium, biofilm formation and translocation of host mucosal barriers. Thirty to 50% S. pneumoniae strains harbor pilus islet-1 (PI-1) coding for a surface exposed pilus reported to be important both for colonization and virulence. In particular it has been clearly demonstrated that pilus component RrgA is the major determinant for adhesion to epithelial cells in vitro whereas RrgB is important to allow the formation of the polymeric structure into which the adhesin is incorporated. The data reported in this work contribute to better define the involvement of S. pneumoniae pili in adhesion to human epithelial cells and providing evidence that anti-pilus antibodies are able to prevent bacterial adherence. In order to test the adhesive attitude of S.pneumoniae strains, we selected a panel of epithelial cell lines differing for their anatomical origin and the capacity to constitute polarized monolayers. Me180 cervical epithelial cells, characterized to form weak adherence junctions and thus expose basolateral surface, result the best model to study pneumococcal adhesiveness. This evidence led us to hypothesize that the pilus ligands may reside in some of the extracellular matrix components rather than in cell associated receptors. Once identified the most appropriate cellular model we started the characterization of pilus dependent adhesion by using TIGR4 mutants lacking pilus components or subpopulations derived from the wild type strain and differing only in pilus expression (highly or poorly piliated). The results reveal that piliated bacteria were drastically more adherent to cells compared to non piliated strains. However, both the lack of the pilus adhesion moiety (RrgA) or of the pilus backbone (RrgB) determined a dramatic reduction of adhesion, suggesting that both the presence of the adhesin and its correct spacing from the bacterial cell were equally important. In addiction we tested the pilus mediated adhesiveness of different pneumococcal strains that could be successfully divided into sub-populations highly (H) or poorly (L) expressing pili. By comparing the H sub-populations we noticed striking difference in their capacity to adhere to host cells. Conventional and immune electron microscopy studies reveal that the capsule thickness is inversely related with the bacterial ability to adhere to host cells likely due to the different exposure of pili on the bacterial surface. Moreover the deletion of the capsular locus in the poorly adherent strain 19FTaiwan14 results in a considerable increase in the adhesion to epithelial cells, at levels comparable to that of poorly capsulated TIGR4 strain. Additionally, in this study, we demonstrate that anti-pilus antibodies were able to significantly impair pneumoccal adhesion to human epithelial cells in strains prominently extruding pili from the capsule. Of interest, we found a monoclonal antibody against RrgA that was able to compete with adhesion in a similar manner with respect to the polyclonal serum against the whole protein. Epitope mapping experiments resulted in the identification of the possible binding region on the RrgA molecule, located in the c-terminal domain. At the moment we are trying to confirm this result by producing point-mutated forms of RrgA with the scope to select mutants that are not recognized by the functional monoclonal antibody and finally complement rrga ko strain with these sequences to confirm the importance of the epitope in the adhesion to human epithelial cells.

Streptococcus pneumoniae è un batterio Gram-positivo che fa parte della normale flora microbica che colonizza in modo asintomatico le vie respiratorie. Tuttavia questo microorganismo è anche uno dei principali patogeni umani, può, infatti, causare gravi infezioni del tratto respiratorio sia in forma non invasiva quali otite media, sinusite e polmonite che in casi più gravi forme invasive quali setticemia e meningite. Sebbene S. pneumoniae sia una delle principali cause di mortalità e morbilità nel mondo, i meccanismi patogenetici di questo batterio non sono ancora stati completamente chiariti. Un punto chiave è la colonizzazione del tratto nasofaringeo e l’interazione dei batteri con le cellule ospiti. A questo proposito, recentemente, sono state identificate nei batteri Gram-positivi delle strutture, note come pili, che svolgono un ruolo cruciale nell’interazione ospite-patogeno, sono infatti coinvolti in processi quali: adesione alle cellule epiteliali, formazione di biofilm e traslocazione degli epiteli. Una percentuale variabile tra il 30% e il 50% dei ceppi di S.pneumoniae contiene nel proprio DNA genomico un elemento genetico noto come pilus islet-1 (PI-1) che codifica per una struttura fibrillare, il pilo di tipo1, coinvolto nei processi di colonizzazione e virulenza. In dettaglio, è stato dimostrato che la sub-unità RrgA è coinvolta nell’adesione in vitro dei batteri alle cellule epiteliali mentre la sub-unità RrgB è il principale costituente della struttura del pilo, all’interno della quale è incorporata l’adesina. I dati riportati in questo lavoro contribuiscono a chiarire il ruolo svolto dal pilo nel meccanismo di adesione di Streptococcus pneumoniae alle cellule epiteliali e forniscono evidenze dell’attività degli anticorpi contro le componenti del pilo di inibire l’adesione dei batteri alle cellule ospiti. Al fine di valutare le capacità di adesione di Streptococcus pneumoniae, abbiamo selezionato una serie di linee cellulari provenienti da diversi distretti anatomici e con diversa capacità di formare un monostrato di cellule polarizzate in vitro. Tra le linee cellulari testate, il miglior modello per lo studio dell’adesione sono le ME180 (cellule epiteliali di cervice uterina) caratterizzate dal formare giunzioni lasse e quindi consentire l’esposizione di componenti della superficie basolaterale. Questo risultato ci fa ipotizzare che il ligando dei pili possa essere un elemento della matrice extracellulare o un recettore posto sulla superficie basolaterale delle cellule. Una volta identificato il modello cellulare ideale, abbiamo analizzato le capacità di adesione pilo-dipendenti di mutanti che mancano delle componenti del pilo e di sottopopolazioni isolate dal ceppo wild type che differiscono tra loro unicamente per una diversa espressione del pilo, una popolazione è altamente piliata, l’altra scarsamente piliata. I risultati mostrano che la popolazione piliata ha una capacità di aderire alle cellule molto più elevata rispetto alla popolazione non piliata. Inoltre abbiamo osservato che sia l’assenza dell’adesina (RrgA) che del backbone (RrgB) determinano una drastica riduzione dell’adesione sottolineando l’importanza per un corretto funzionamento del pilo sia della presenza dell’adesina che della sua localizzazione nella struttura del pilo. Successivamente abbiamo analizzato il contributo del pilo nell’adesione in diversi ceppi di Streptococcus pneumoniae selezionati sulla base della possibilità di poter isolare le due sottopopolazioni con diversa espressione del pilo (popolazione piliata e non piliata). Prendendo in esame le sottopopolazioni pilate dei ceppi selezionati abbiamo osservato notevoli differenze nella capacità di aderire alle cellule epiteliali. Per spiegare questo fenomeno abbiamo condotto studi di microscopia elettronica convenzionale e immuno-elettro microscopia che hanno evidenziato la presenza di una correlazione inversa tra lo spessore della capsula e le capacità adesive pilo-dipendenti, molto probabilmente dovuta alla diversa esposizione dei pili sulla superficie del batterio. Infatti, la delezione dell’intero locus capsulare in un ceppo che mostra scarsa capacità di adesione alle cellule epiteliali come il ceppo 19FTaiwan14, comporta un notevole aumento dell’adesione a livelli paragonabili al ceppo TIGR4 che è scarsamente capsulato. In questo lavoro abbiamo anche dimostrato che anticorpi prodotti contro le componenti del pilo sono in grado di inibire l’adesione dei batteri alle cellule epiteliali in ceppi in cui il pilo è molto esposto al di fuori della capsula e abbiamo identificato un anticorpo monoclonale anti-RrgA in grado di bloccare l’adesione dei batteri alle cellule ospiti in modo comparabile al siero policlonale prodotto contro l’intera proteina. Studi di epitope mapping hanno portato all’identificazione della regione di RrgA probabilmente coinvolta nel binding con l’anticorpo monoclonale, localizzata nel dominio c-terminale della proteina. Attualmente stiamo cercando di confermare questi risultati inserendo nella regione di RrgA che abbiamo identificato delle mutazioni puntiformi per ottenere forme mutate dell’epitopo che non vengano più riconosciute dal monoclonale e infine complementare il ceppo mutante rrga con queste sequenze per confermare l’importanza di questo epitopo nell’adesione alle cellule epiteliali umane.