Astrocyte-microglia interaction in the expression of a pro-inflammatory or pain-related phenotype: molecular and cellular aspects

In the central nervous system (CNS), glial cells not only serve supportive and nutritive roles for neurons, but also respond to protracted stress and insults by up-regulating inflammatory processes. Reactive astrocytes and microglia have been detected in animal models of neuronal injury such as ischemia, axotomy, and neurotoxic insult, and in the human brain in neurodegenerative diseases. Reactive glial cells produce a wide array of pro-inflammatory molecules, including nitric oxide, cytokines and chemokines. The complexity of studying glial activation in vivo has led to the widespread adoption of in vitro approaches, for example the use of the bacterial toxin lipopolysaccharide (LPS, a ligand for toll-like receptor 4 (TLR4)) as an experimental model of glial activation. In the latter, however, the contribution of microglia, if any, to the response by astrocytes remains an open question, as such astrocyte cultures frequently contain minor numbers of microglia. In the present study, we set up a in vitro model to evaluate the interaction between astrocytes and microglia in the CNS. At first we used mixed glial cultures from neonatal rat cortex and spinal cord, and we control for the presence of other cell types (endothelium, oligodendrocytes, and neurons). Then we purified microglia and enriched astrocyte cultures in order to evaluate the response to inflammatory (LPS), or pain stimuli (substance P, vasoactive intestinal peptide, calcitonin gene related peptide). Under our experimental conditions, we demonstrated that enriched astrocyte cultures respond to LPS for longer times than purified microglia, but glial cultures lack response to peptides involved in neuronal pain transmission. Subsequently, enriched (<5% microglia) astrocytes cultured from neonatal rat cortex and spinal cord were treated with the lysosomotropic agent L-leucine methyl ester to eliminate residual microglia, as confirmed by loss of microglia-specific marker genes. L-Leucine methyl ester treatment lend to a loss of LPS responsiveness, in terms of nitric oxide and cytokine gene up-regulation and mediator output into the culture medium. Astrocyte responsiveness could be reconstituted by re-addition of increasing numbers of purified microglia which, by themselves, yielded little or no signal upon LPS exposure. Given that astrocytes greatly outnumber microglia in the CNS, these data suggest that a similar ‘cross-talk’ between microglia and astrocytes in vivo may be an important element in the evolution of an inflammatory pathology. In the absence of pathogens, TLR signaling can be activated by molecules called damage associated molecular patterns, released by the injured tissue. The astrocyte/microglia co-culture paradigm described here may provide a useful starting point to elucidate the molecular mechanisms underlying astrocyte- and microglia-specific responses pertaining to, although not limited to, CNS inflammation, especially where TLR activation plays a role.

Nel sistema nervosa centrale (SNC), le cellule gliali non svolgono solamente una funzione di supporto ai neuroni, ma rispondono “attivandosi” a rilevanti stress e insulti chimici. Astrociti e microglia attivati sono stati individuati in modelli animali in cui è stata indotta una lesione del SNC, ischemia, assotomia, neurotossicità da tossine neurotossiche, e, nel caso dell’uomo, in malattie neurodegenerative. Cellule gliali attivate possono rilasciare diversi fattori pro-infiammatori, come l’ossido nitrico, citochine e varie chemochine, agenti, questi, tutti coinvolti nei processi infiammatori. Tuttavia, poiché questo fenomeno risulta piuttosto complesso in vivo, numerosi studi hanno cercato di allestire dei modelli in vitro in grado di comprendere il contributo delle varie cellule gliali nell’infiammazione, nel dolore cronico e in quello neuropatico. Classici modelli di infiammazione a livello del SNC, coinvolgono i recettori dell’immunità innata della famiglia Toll-like (TLR), in particolare il recettore TLR4. In vitro e in vivo, trattando con lipopolisaccaridi (LPS) batterici colture cellulari da tessuto nervoso o animali, si induce uno stato di attivazione della microglia e degli astrociti simile a quello presente nell’infiammazione. Tuttavia, nonostante in numerosi studi sia stato dimostrato il coinvolgimento della microglia nel fenomeno infiammatorio ed algico, resta ancora poco chiaro il preciso ruolo degli astrociti, poiché le colture di quest’ultimi contengono spesso delle contaminanti di microglia. In questo studio, abbiamo allestito un modello in vitro utile per valutare le interazioni tra astrociti e microglia nei fenomeni infiammatori ed algici. Inizialmente abbiamo utilizzato colture gliali miste ottenute da corteccia e midollo spinale di ratto neonato di due giorni. Abbiamo valutato la presenza nella coltura cellule oligodendrocitarie, endoteliali e neuronali, evidenziando come sostanzialmente la coltura fosse composta quasi esclusivamente da cellule microgliali e astrocitarie. Successivamente, separando la microglia dagli astrociti, abbiamo ottenuto colture arricchite in astrociti, le quali evidenziano una contaminante di microglia inferiore al 5%. Queste colture sono state quindi stimolate con LPS, o con peptidi coinvolti nella genesi o nel mantenimento dello stimolo algico a livello neuronale (quali sostanza P, peptide intestinale vasoattivo, peptide correlato al gene della calcitonina, ecc.). Abbiamo quindi dimostrato che, nelle nostre condizioni sperimentali, le colture arricchite in astrociti rispondono, al trattamento con LPS, per periodi più prolungati rispetto alla microglia purificata. Tuttavia, entrambe le colture gliali non evidenziano nessuna risposta pro-infiammatoria quando trattate con i tre neuro-peptidi testè elencati. Successivamente, le colture arricchite in astrociti sono state trattate con l’agente lisosomotropico L-Leucina metil estere (L-LME), un composto che, come dimostrato nelle nostre colture, è in grado di causare la morte della microglia e la conseguente scomparsa dei suoi marcatori genici specifici. Dopo trattamento con L-LME, la coltura pura di astrociti evidenzia una perdita di risposta all’LPS sia in termini di assenza di induzione trascrizionale dei geni che codificano l’enzima inducibile nitrico sintasi e alcune citochine infiammatorie, come pure di un mancato rilascio di questi fattori nel mezzo di coltura. La risposta degli astrociti all’LPS può essere ripristinata mediante riaggiunta alle colture astrocitarie di quantità crescenti di cellule microgliali. Tuttavia se le stesse quantità di cellule di microglia utilizzate nella riaggiunta, vengono coltivate in assenza di astrociti, esse evidenziano una risposta all’LPS significativamente minore. Poiché nel SNC gli astrociti sono presenti in numero molto superiore alla microglia, questi dati suggeriscono che come in vitro, anche in vivo, potrebbe esistere una cooperazione tra astrociti e microglia e ciò potrebbe risultare di vitale importante nella genesi e nel mantenimento dell’infiammazione e del dolore patologico. Infatti, anche in assenza di patogeni nel SNC, i recettori TLR dell’immunità innata, possono essere attivati da fattori della famiglia delle proteine associate a danni molecolari (damage associated molecular patterns, DAMP) che vengono attivati da danni cellulari che non implicano una risposta infiammatoria da tossine batteriche. La co-coltura di astrociti e microglia descritta nel presente studio può rappresentare, quindi, un punto di partenza per chiarire il meccanismo molecolare che sottintende alla specifica risposta infiammatoria mediata da astrociti e microglia, causata dall’attivazione dei recettori della famiglia TLR.