Functional characterization of a ripening induced RGF-like peptide hormone in peach

In the vascular plants the coordination of developmental processes, cell-cell interactions and physiological processes are mediated by the action of phytohormones, whose chemical structures include simple molecules as olefin (ethylene) and complex steroids as brassinolide. Moreover, little signal peptides were recognized to have a role as phytohormones. Such peptides were involved in defense response, callus growth, meristems homeostasis, root growth, organ abscission and hormone crosstalk. The peach peptide encoded by the ctg134 gene represents a possible candidate as mediator in the interplay between auxin and ethylene. Initially annotated as a gene of unknown function, it drawn attention because of its expression, noted by means of microarray experiments on ripening peach. Indeed, it is induced by ripening, but, unlikely many ripening-associated genes, it is also induced by auxin and 1-methylciclopropene (1-MCP) and repressed by ethylene. Recently it turned out that its sequence is similar to those of RGF (Root Growth Factors) genes, characterized in Arabidopsis thaliana only in 2010. The ctg134 promoter fusion with the GUS reporter gene was used to create transgenic lines in tobacco and Arabidopsis, that displayed a staining pattern associated to cells where an ethylene/auxin crosstalk might occur, such as lateral roots formation and organ abscission. Treatments with exogenous auxin on pctg134::GUS seedlings demonstrated that the promoter is able to respond to low concentrations of auxin and that the response reaches the maximum level within six hours from the begins of the treatment. The ctg134 overexpression in tobacco allowed to observe an increase of the root hair number and growth and the enlargement of capsules size. Both the phenotypes may be due to an enhanced sensitivity to ethylene. This aspect was confirmed by molecular analyses on ACO genes in tobacco seedlings overexpressing the peptide encoded by ctg134. The obtained data seem to confirm that ctg134 is really active in the crosstalk between the two hormones, being induced by auxin and leading to an increased ethylene sensitivity in some tissues. To facilitate the functional analysis of regulatory genes involved in fruit development and ripening, new tools for gene expression were set up by modification of a two-component expression system based on transactivation. This vectors were adapted for specific gene overexpression in tomato fruits and are now available to future functional characterizations of genes involved in ripening processes.

Nelle piante superiori la coordinazione delle interazioni cellula-cellula, durante i diversi stadi di sviluppo, è mediata prevalentemente da ormoni vegetali la cui natura chimica spazia da semplici molecole, come l’etilene, a molecole dalla struttura più complessa, come i brassinosteroli. Inoltre sono stati recentemente riconosciuti come importanti segnali intercellulari anche piccoli peptidi, con funzione ormonale, in grado di coordinare e definire specifiche funzioni nelle piante. Questi sono coinvolti in numerosi processi, come le risposte di difesa, la crescita del callo, l’organizzazione del meristema, la crescita delle radici, i fenomeni di abscissione e il cross-talk tra ormoni. In pesco, il peptide codificato dal gene ctg134 rappresenta un possibile candidato come mediatore nell’interazione tra auxina ed etilene. Inizialmente annotato come gene a funzione sconosciuta, il ctg134 è stato identificato mediante esperimenti di microarray condotti nell’ambito di studi sul processo di maturazione della pesca. Ulteriori esperimenti hanno mostrato come tale gene sia indotto dalla maturazione e, diversamente dagli altri geni legati a tale sindrome, sia indotto dall’auxina e dall’1-MCP, ma represso dall’etilene. Recentemente è stato evidenziato come esso presenti numerose similitudini con i peptidi ormonali appartenenti alla classe RGF (Root Growth Factor), caratterizzati in Arabidopsis. Fusioni del promotore con il gene GUS sono state utilizzate per creare linee transgeniche di tabacco e Arabidopsis, nelle quali è stata evidenziata attività del promotore in cellule in cui ci potrebbe essere interazione tra auxina e etilene, come la formazione di radici laterali e l’abscissione di organi. Trattamenti con auxina esogena su germinelli di tabacco pctg134::GUS hanno permesso di evidenziare come la sequenza regolatrice risponda a bassi livelli di auxina esogena e la risposta sia massima entro 6 ore dall’applicazione dell’ormone. La sovraespressione del gene codificante il ctg134 in piante di tabacco ha reso possibile osservare nelle radici un aumento della lunghezza e del numero dei peli radicali e, nella parte riproduttiva, l’ingrossamento dell’ovario. Entrambi i fenotipi potrebbero essere dovuto a un’aumentata sensibilità all’etilene. Questo aspetto è stato confermato dall’analisi dell’espressione dei geni ACO in germinelli di tabacco che sovra-esprimono il peptide codificato dal ctg134. I dati ottenuti sembrano confermare come il ctg134 sia realmente attivo nel cross-talk tra auxina ed etilene, essendo indotto dall’auxina e portando ad un aumento nella sensibilità all’etilene in vari tessuti. Per facilitare l’analisi funzionale di geni regolatori implicati nel processo di sviluppo e maturazione del frutto, sono stati messi a punto nuovi strumenti per la sovra-espressione genica attraverso la modificazione di un sistema di vettori a due componenti basato sul fenomeno della transattivazione. Questi vettori sono stati adattati per ottenere un’espressione specifica nella bacca di pomodoro, e sono ora disponibili per futuri studi di caratterizzazione funzionale di geni coinvolti nel processo di maturazione.