Rilevanza biologica e pre-clinica del recettore tirosin chinasico ALK nel rabdomiosarcoma

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common pediatric soft-tissue sarcoma in childhood and arises as a consequence of regulatory disruption of the growth and differentiation pathways of myogenic precursor cells. RMS are divided in two main subgroups on the basis of histology: alveolar (ARMS) and embryonal (ERMS). ARMS, which is associated with a relatively high frequency of metastatic disease and needs an intensive therapeutic regimen, is the rhabdomyosarcoma subtype that carries the poorest prognosis. It comprises the 20% of patients and is characterized by specific chromosomal translocations, t(2;13)(q35;q14) and t(1;13)(p36;q14), that originate abnormally regulated fusion protein PAX3- and PAX7-FKHR, respectively. In contrast to ARMS, ERMS occurs at younger age, has a better prognosis and it is associated with an 11p15.5 loss of heterozygosity (LOH) and it comprises 80% of all RMS. Nowadays, the detection of genetic imbalances is used for a correct and rapid diagnosis of RMS subtypes, but prognostic biomarkers and factors that increase patient’s survival are not known. Recently, expression of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) has been observed in RMS, but its role has not been investigated. ALK is a receptor tyrosine kinase (RTK) described as the constitutively active fusion protein in different tumors and, as membrane protein, in neurons of the central and peripheral nervous system at late embryonic stages. Recently ALK was also found in other malignant cancers, such as glioblastomas and neuroblastomas, associated to genetic aberrations, such as amplifications or point mutations. ALK has an extracellular ligand-binding region, a transmembrane-spanning domain and a kinase catalytic region. ALK is known to be activated through autoactivation in vitro, as the other RTK, in which ligands induce dimerization that results from conformational changes in the active site and lead to autophosphorylation with activated downstream signalling pathways, critical for cell proliferation and survival. However, the growth factor to enforce ALK dimerization and activation is still unknown, althought recently pleiotrophin (PTN) and midkine (MK) were proposed to be the physiological ligands. In this study we evaluated the biological and preclinical relevance of ALK in RMS, given that ALK has been originally described in RMS cell lines, but its function has not been studied. ALK expression was evaluated in 9 RMS cell lines, 4 ERMS and 5 ARMS, by Real Time PCR and western blotting, and we found that ALK expression level is higher in alveolar RMS cells having PAX-FKHR gene. Furthermore no basal self-activation of ALK was detected, suggesting that ALK is constitutively inactive differently from the fusion protein NPM-ALK in ALCL or EML4-ALK in NSCLC, therefore its dimerization is ligand-dependent. Our data suggest that PTN and MK failed to activate ALK in RMS cell lines, indicating different regulatory mechanisms. In fact we do not observe neither tyrosine phosphorylation in kinasic domain of ALK or activation of the signalling pathways downstream of the receptor. To elucidate the role of ALK in RMS, we used an agonist monoclonal antibody (mAb16-39) against the extracellular domain to induce dimerization. Stimulation of RMS cells markedly induces the phosphorylation of ALK and of proteins involved in cell proliferation and survival (MAPK; PI3K/AKT). ALK inhibition decreased tyrosine phosphorylation of ALK and of signalling pathways, which increased programmed cell death (apoptosis) and cell cycle arrest. In conclusion, ALK function is still unknown in RMS, althought our data suggest an important role in RMS tumorigenesis.

Il rabdomiosarcoma (RMS) è il più comune sarcoma pediatrico dei tessuti molli che si sviluppa come conseguenza dell’alterazione dei pathways che controllano la crescita e la differenziazione dei precursori del tessuto muscolare striato. Il RMS presenta due principali sottotipi istologici: il rabdomiosarcoma alveolare (ARMS) ed embrionale (ERMS). Il RMS alveolare è associato ad una più spiccata tendenza alla disseminazione, necessita di un regime terapeutico più aggressivo e presenta una prognosi sfavorevole. Comprende circa il 20% dei casi ed è caratterizzato da traslocazioni cromosomiche specifiche, t(2;13)(q35;q14) e t(1;13)(p36;q14), le quali danno origine alle proteine di fusione PAX3-FKHR e PAX7-FKHR, rispettivamente. A differenza degli ARMS, i RMS embrionali costituiscono l’80% dei casi, sono più frequenti nei bambini più piccoli, sono associati a perdita di eterozigosi al locus 11p15.5, ma hanno una prognosi migliore. Attualmente, l’analisi di alterazioni genetiche è usata per una corretta e rapida diagnosi dei RMS, anche se non sono ancora stati trovati fattori e biomarkers prognostici che possano essere utilizzati per incrementare la sopravvivenza dei pazienti. Recentemente è stata descritta l’espressione delle chinasi ALK nei RMS, ma il suo ruolo rimane sconosciuto. ALK è un recettore tirosin-chinasico (RTK) descritto come proteina di fusione costitutivamente attiva NPM-ALK nei linfomi anaplastici (ALCL) e come proteina di membrana è espressa nei neuroni del sistema nervoso centrale e periferico durante lo sviluppo embrionale. Recentemente ALK è stato descritto anche in diversi tumori maligni, come nel glioblastoma e nel neuroblastoma frequentemente associato ad aberrazioni geniche quali amplificazioni o mutazioni puntiformi. ALK è costituito da una regione extracellulare in cui si legano i substrati, un dominio trans-membrana e un dominio chinasico catalitico. Come per altri RTK, l’attivazione di ALK necessita di una dimerizzazione ligando-dipendente, in cui i domini chinasici si fosforilano a vicenda e attivano vie di segnale critiche per la proliferazione e sopravvivenza cellulare, come MAPK ERK1/2 e PI3K AKT. I fattori di crescita che determinano la dimerizzazione e l’attivazione di ALK sono ancora sconosciuti, anche se recentemente sono stati proposti pleiotropina (PTN) e midkine (MK) come possibili ligandi. In questo studio, abbiamo valutato la rilevanza biologica e pre-clinica di ALK nei RMS, dal momento che è stato descritto per la prima volta in linee cellulari di RMS, ma la sua funzione non è mai stata studiata. L’espressione di ALK è stata valutata in 9 linee cellulari di RMS, 4 ERMS e 5 ARMS, mediante Real Time PCR e western blotting, osservando che ALK è maggiormente espresso nelle linee di RMS alveolare che esprimono l’oncogene PAX-FKHR. Tuttavia, ALK risulta inattivo nelle cellule di RMS, a differenza di NPM-ALK negli ALCL o di EML4-ALK in NSCLC, e per la sua attivazione necessita di una dimerizzazione ligando-dipendente. I risultati ottenuti nel nostro laboratorio indicano però che PTN e MK non sono in grado di attivare ALK nelle linee cellulari di rabdomiosarcoma suggerendo meccanismi di regolazione diversi da quelli finora descritti. Infatti non si osservano né la fosforilazione a livello delle tirosine presenti nel sito chinasico né l’attivazione delle vie di segnale. Per capire il ruolo di ALK, è stato quindi utilizzato un anticorpo monoclonale agonista (mAb16-39) in grado di legarsi al dominio extracellulare di ALK e stimolarne la dimerizzazione. In queste condizioni, è stato possibile osservare un aumento della fosforilazione di ALK e di proteine implicate nei fenomeni di proliferazione e sopravvivenza cellulare tumorale (MAPK; PI3K/AKT). L’inibizione di ALK determina una diminuzione della fosforilazione di ALK, e della trasduzione del segnale che risulta in un aumento della morte cellulare programmata (apoptosi). In conclusione il ruolo di ALK nei RMS rimane ancora largamente sconosciuto, anche se i nostri dati sembrano suggerire un ruolo importante di ALK nella tumorigenesi del RMS.