A novel role for heparanase in the onset of liver fibrosis establishment

Heparan sulfate proteoglycans are important structural and functional components of basal membranes composed of a core protein (soluble or transmembrane) covalently linked to highly sulfated chains of glycosaminoglycans called heparan sulfate. Heparanase is the only endoglucuronidase capable of cleaving heparan sulfate chains of heparan sulfate proteoglycans. It exerts its enzymatic activity by catalyzing the cleavage of the β(1,4)-glycoside bond between glucuronic acid and glucosamine residues, generating fragments of about 5–7kDa. At intracellular level (endosomal and lysosomal), heparanase participates in the turnover of membrane-associated heparan sulfate proteoglycans, while secreted enzyme is involved in the remodeling and degradation of extracellular matrix. Given the electrostatic interaction of heparan sulfate with growth factors, cytokines and enzymes, heparanase cleavage indirectly facilitates the release and diffusion of these molecules. Heparanase exerts also non-enzymatic functions since it regulates gene expression by the activation of specific signaling pathways. Through degradation of heparan sulfate chains and heparan sulfate-independent functions, HPSE regulates several physiological and pathological processes. In particular, heparanase has a significant role in tumor progression and in renal glomerular diseases. In addition, it was recently shown its involvement also in bowel and kidney chronic inflammation as well as in tubulo-interstitial fibrosis. In general, fibrosis is an unregulated process of tissue repair that occurs in response to persistent damage and chronic inflammation. In the liver, the progressive accumulation of extracellular matrix can lead to cirrhosis and organ failure. In this process, activated Kupffer cells and hepatic stellate cells (HSCs) play a fundamental role, the first in the inflammatory response, the latter in fibrogenesis. The involvement of heparanase in the development of chronic liver disease has not been demonstrated so far. Given the reproducibility of the mechanisms that contribute to the development of chronic diseases, this study was aimed to: i) investigate whether heparanase is up-regulated during chronic liver disease, ii) study the possible regulation of its expression and iii) study the possible effects on the development of the disease. The tempo-spatial expression of heparanase was studied in mice with chronic hepatic damage induced by carbon tetrachloride (CCl4) administration for 1, 2, 8 and 12 weeks. The progression of chronic injury and fibrosis was assessed by Azan-Mallory and Hematoxylin-Eosin histological stainings. Extensive centrilobular areas with necro-inflammatory activity and fibrosis were observed after 1 and 2 weeks of treatment that progressively developed fibrotic septa and micronodular cirrhosis observed after 8 and 12 weeks of treatment. Analyses of gene expression (by real time RT-PCR) and protein expression (by western blot and immunofluorescence), showed a significant increase of heparanase expression in liver tissue after 1 and 2 weeks of treatment but not after 8 and 12 weeks suggesting a possible role in the early stages of chronic damage. Immunohistochemical analyses revealed the localization of heparanase in the centrilobular areas with necro-inflammatory damage and fibrosis. To identify the cellular source responsible for heparanase increase in tissue, in vitro analyses on cell cultures and co-immunofluorescence analyses on sections from 1 and 2 week-treated livers were performed. Given heparanase localization in fibrotic areas and the fundamental role of the HSCs in chronic liver disease, we wondered if the expression of heparanase increases in HSC during their activation. For this purpose, primary HSCs were isolated from rat livers and induced to activate through culture on plastic dishes. After 15 days of isolation, the levels of heparanase and transdifferentiation markers (α-SMA, fibronectin, TGF-β and collagen I) expression increased significantly compared to cells cultured for 7 days. However, despite immunofluorescence analyses on liver sections revealed the expression of heparanase by in vivo activated HSCs at 1 and 2 weeks of treatment with CCl4, a more significant degree of co-localization was observed with macrophages labeled with F4/80 and CD68. Given the main involvement of macrophages in increasing hepatic heparanase in the sites of inflammation, an analysis of the possible mechanisms of heparanase up-regulation by inflammatory macrophages was then conducted. To this purpose, primary Kupffer cells were isolated from rat livers and treated with LPS and TNF-α, two important pro-inflammatory stimuli. In contrast to LPS, that did not alter the expression of heparanase, TNF-α induced a significant increase of heparanase expression. Also human U937 macrophages, treated with increasing concentrations of TNF-α, increased the heparanase gene and protein levels, in a dose-dependent mechanism. By Western blot on the conditioned media from cells treated or not with TNF-α, we also showed an increase of extracellular enzyme in the presence of TNF-α, indicating that this factor stimulates also heparanase secretion. In addition, two observations provided further evidence on the possible role of TNF-α as a regulator of heparanase expression in chronic liver disease: first, the significant increase in TNF-α expression in the liver tissue only at 1 and 2 weeks of intoxication by CCl4 and, secondly, its co-localization with heparanase at the same weeks of treatment. Among the other pro-inflammatory molecules tested, while IFN-γ stimulated heparanase gene transcription, IL-4 reduced its expression thus suggesting a different regulation of heparanase by macrophages depending on their state of M1 or M2 polarization. The observation of enhanced heparanase expression in the early stages of chronic liver disease led to wonder what it could be its role in the process of fibrogenesis. Given the involvement of Kupffer cells in the activation of HSC through the release of pro-fibrotic stimuli, we examined whether a mechanism of regulation through the release of heparanase was also possible. For this purpose, LX-2 stellate cells were treated with the conditioned media of U937 cells that were previously induced to produce heparanase by stimulation with TNF-α. The involvement of heparanase in the activation of LX-2 has been verified using an heparanase inhibitor during treatment. The results showed that heparanase is able to regulate the expression of α-SMA and fibronectin by LX-2 cells. Besides extracellular matrix degradation, the promotion of macrophage activation by heparanase is already known. In this study, using an in vitro migration assay, we demonstrated that heparanase is also able to stimulate the migration of macrophages. Finally, to verify the involvement of heparanase also in human liver fibrosis, the levels of heparanase activity were measured in the plasma of healthy subjects and patients with chronic liver disease, of viral or autoimmune etiology and at different stages of fibrosis. Accordingly to the animal model, we showed that, regardless of the etiology of hepatic disease, heparanase plasma activity increased in patients with mild and moderate fibrosis compared to healthy subjects, but returned to baseline in patients with cirrhosis. In addition, in patients, plasma heparanase activity negatively correlated with the degree of liver stiffness. Overall, our results indicate the involvement of heparanase in chronic liver disease but only in its early stages. Inflammatory macrophages and, to a lesser extent, activated HSCs are an important source of heparanase. In this context, secreted heparanase in the extracellular environment may play a role in the macrophage-mediated activation of HSCs and in the migration of macrophages themselves.

I proteoglicani dell'eparan solfato sono importanti componenti strutturali e funzionali delle membrane basali costituiti da un asse proteico (solubile o transmembrana) legato covalentemente a catene altamente solfatate di glicosaminoglicani chiamate eparan solfato. L'eparanasi è l'unico enzima in grado di tagliare le catene di eparan solfato a livello di specifici siti intracatena, generando frammenti di circa 5-7kDa. Essa si definisce endo-β-D-glucuronidasi, in quanto capace di tagliare i legami glicosidici tra i monomeri di acido glucuronico a glucosamina che costituiscono l'eparan solfato. A livello intracellulare (endosomale e lisosomale), l'eparanasi partecipa al turnover dei proteoglicani dell'eparan solfato associati alla membrana cellulare mentre, quando secreta, è coinvolta nella degradazione e nel rimodellamento della matrice extracellulare. Data l'interazione elettrostatica dell'eparan solfato con fattori di crescita, citochine ed enzimi, il suo taglio da parte dell'eparanasi facilita indirettamente anche il rilascio e la diffusione di queste molecole. L'eparanasi svolge poi funzioni non enzimatiche in quanto è in grado di regolare l'espressione genica attraverso l'attivazione di vie di segnalazione intracellulari. Nello svolgere queste funzioni, l'eparanasi è coinvolta sia in processi fisiologici che patologici. In particolare l'eparanasi ha un ruolo significativo nella progressione tumorale e nelle malattie glomerulari renali. Inoltre, è stato recentemente dimostrato il suo coinvolgimento anche nell'infiammazione cronica a livello intestinale e renale così come nella fibrosi tubulo-interstiziale. In generale, la fibrosi è un processo sregolato di riparazione tissutale che insorge in seguito ad un danno persistente e ad infiammazione cronica. Nel fegato, il progressivo accumulo di matrice extracellulare può portare a cirrosi e insufficienza epatica. In questo processo, l'attivazione delle cellule di Kupffer e delle cellule stellate (HSC) svolge un ruolo fondamentale, le prime nella risposta infiammatoria, le seconde nella fibrogenesi. Finora, nessuno studio ha dimostrato un coinvolgimento dell'eparanasi nello sviluppo della malattia cronica epatica. Considerata la riproducibilità dei meccanismi che concorrono allo sviluppo delle malattie croniche, questo studio ha lo scopo di: i) verificare se l'eparanasi sia up-regolata nel corso della malattia cronica di fegato, ii) studiare l'eventuale regolazione della sua espressione e iii) studiare i possibili effetti sullo sviluppo della malattia. Il quadro di espressione temporo-spaziale dell'eparanasi è stato studiato in topi con danno cronico epatico indotto da somministrazioni di tetracloruro di carbonio (CCl4) per 1, 2, 8 e 12 settimane. La progressione del danno cronico e della fibrosi è stata valutata tramite le colorazioni istologiche di Azan-Mallory ed Ematossilina-Eosina. Estese aree centrolobulari ad elevata attività necro-infiammatoria e fibrosi si sono osservate dopo 1 e 2 settimane di trattamento che hanno progressivamente generato fasci fibrotici e cirrosi micronodulare osservati dopo 8 e 12 settimane di trattamento. Analisi di espressione genica (tramite real time RT-PCR) e proteica (tramite Western blot e immunofluorescenza), hanno dimostrato un significativo aumento di espressione dell'eparanasi dopo 1 e 2 settimane di trattamento ma non dopo 8 e 12 settimane suggerendo un possibile ruolo dell'enzima nelle fasi iniziali del danno cronico. Analisi di immunoistochimica hanno poi evidenziato una localizzazione dell'eparanasi nelle aree centrolobulari con danno necro-infiammatorio e fibrosi. Per identificare la sorgente cellulare di eparanasi responsabile del suo aumento tissutale, sono state condotte analisi in vitro su colture cellulari ed analisi di co-immuofluorescenza su sezioni di fegato trattato con CCl4 per 1 e 2 settimane. Data la localizzazione dell'eparanasi nelle aree fibrotiche e il ruolo fondamentale delle HSC nella malattia cronica di fegato, ci siamo chiesti se l'espressione di eparanasi aumenti nelle HSC durante la loro attivazione. A tal scopo, cellule primarie sono state isolate da fegato di ratto e indotte ad attivarsi tramite coltura su plastica. Dopo 15 giorni dall'isolamento, i livelli di espressione dell'eparanasi e di marcatori del transdifferenziamento (α-SMA, fibronectina, TGF-β e collagene I) sono significativamente aumentati rispetto a cellule coltivate per 7 giorni. Tuttavia, nonostante analisi di immunofluorescenza abbiano evidenziato l'espressione di eparanasi da parte di HSC attivate in vivo a 1 e 2 settimane di trattamento con CCl4, un più significativo grado di co-localizzazione è stato osservato con i macrofagi marcati con F4/80 e CD68. Dato il principale coinvolgimento dei macrofagi nell'aumento di eparanasi epatica in sede di infiammazione, è stata quindi condotta un'analisi sui possibili meccanismi di up-regolazione dell'eparanasi da parte dei macrofagi infiammatori. A tal scopo, cellule primarie di Kupffer sono state isolate da fegato di ratto e trattate con LPS e TNF-α, due importanti stimoli pro-infiammatori. Al contrario dell'LPS che non ha alterato l'espressione dell'eparanasi, il TNF-α ne ha indotto un significativo aumento. Anche macrofagi umani U937, trattati con concentrazioni crescenti di TNF-α, hanno aumentato l'espressione genica e proteica dell'eparanasi, con un meccanismo dose-dipendente. Tramite Western blot sui mezzi condizionati di U937 trattate o meno con TNF-α, abbiamo inoltre dimostrato un incremento di enzima extracellulare in presenza di TNF-α, suggerendo come questo fattore stimoli anche la secrezione di eparanasi. Due osservazioni hanno poi fornito ulteriori evidenze sul possibile ruolo del TNF-α come regolatore dell'espressione dell'eparanasi nella malattia cronica epatica: in primo luogo il significativo aumento di espressione del TNF-α nel tessuto epatico solo a 1 e 2 settimane di intossicazione da CCl4 e, in secondo luogo, la sua co-localizzazione con l'eparanasi alle stesse settimane di trattamento. Tra le altre molecole pro-infiammatorie testate, mentre IFN-γ ha stimolato la trascrizione genica dell'eparanasi, IL-4 ne ha ridotto l'espressione suggerendo una diversa regolazione dell'eparanasi da parte dei macrofagi a seconda del loro stato di polarizzazione M1 e M2. L'elevata espressione dell'eparanasi negli stadi iniziali della malattia cronica di fegato ha portato a chiederci quale potesse essere il suo ruolo nel processo di fibrogenesi. Dato il coinvolgimento delle cellule di Kupffer nell'attivazione delle HSC tramite il rilascio di stimoli pro-fibrotici, abbiamo verificato se fosse possibile un meccanismo di regolazione anche attraverso il rilascio di eparanasi. A tale scopo, cellule stellate LX-2 sono state trattate con i mezzi condizionati delle U937 precedentemente indotte a produrre eparanasi tramite stimolazione con TNF-α. Il coinvolgimento dell'eparanasi nell'attivazione delle LX-2 è stato verificato utilizzando un inibitore dell'eparanasi durante il trattamento. I risultati hanno dimostrato come l'eparanasi sia in grado di regolare l'espressione di α-SMA e di fibronectina da parte delle LX-2. Oltre alla degradazione della matrice extracellulare, anche la capacità di promuovere l'attivazione dei macrofagi è un'attività dell'eparanasi già nota. In questo studio, tramite un saggio di migrazione in vitro, è stato dimostrato come la forma latente dell'eparanasi sia in grado di stimolare anche la migrazione dei macrofagi. Infine, per verificare il coinvolgimento dell'eparanasi nella fibrosi epatica umana, i livelli di attività dell'eparanasi sono stati misurati nel plasma di soggetti sani e pazienti affetti da malattia cronica di fegato, ad eziologia virale o autoimmune e a diversi stadi di fibrosi. A conferma di quanto riscontrato nel modello animale, abbiamo osservato come, indipendentemente dall'eziologia della malattia epatica, l'attività plasmatica dell'eparanasi aumenti nei pazienti con fibrosi lieve e moderata rispetto ai soggetti sani, ma ritorni basale nei pazienti cirrotici. Inoltre, nei pazienti, l'attività plasmatica dell'eparanasi correlava negativamente con il grado di stiffness epatica. Complessivamente, i nostri risultati indicano un coinvolgimento dell'eparanasi nella malattia cronica di fegato ma solo nelle sue fasi iniziali. Macrofagi infiammatori e, in misura minore, HSC attivate costituiscono un'importante fonte di eparanasi. In questo contesto, l'eparanasi secreta nell'ambiente extracellulare può avere un ruolo nell'attivazione delle HSC mediata dai macrofagi e nella migrazione dei macrofagi stessi.