Transcription factor EB controls metabolic flexibility during exercise

Skeletal muscle is the most abundant tissue in the whole organism representing more than 40% of the total body mass. This organ is responsible for the 30% of metabolic rate in basal condition, suggesting its great relevance not only for locomotor activity, but also for the control of whole body metabolism. Indeed skeletal muscle is a highly dynamic tissue that modulates its metabolism and mass as a consequence of different physiopathological conditions. One stimulus that triggers major adaptations is exercise, which is also well known to activate autophagy (Grumati, Coletto, Schiavinato, et al., 2011). Physical exercise elicits several beneficial effects acting on mitochondrial content/function, fatty acid oxidation and glucose uptake; however it is considered a disruptive trigger for myofiber homeostasis that needs to be counterbalanced through the activation of transcriptionally regulated pathways ready to contrast mechanical and metabolic stresses produced during contraction. The role of FoxOs transcription factors and TFEB in regulating protein breakdown and autophagy is known (Milan et al., 2015; Settembre et al., 2011). However the role of TFEB in skeletal muscle and its possible effects in controlling exercise-dependent adaptations in this tissue were not proved. TFEB has been proposed as the key factor that coordinates autophagy to lysosomal biogenesis in cell culture, with different evidences showing the regulation of its activity. In particular it is known that an mTORC1 phosphorylation is able to prevent TFEB function by retaining it in the cytoplasm. However, there were no evidences concerning the possible phosphatases involved in TFEB activation. Using a cellular high content screening able to monitor TFEB nuclear translocation during starvation, we identified PPP3CB, the catalytic subunit of calcineurin, as one of the highest hit for TFEB nuclear relocalization. We demonstrated that calcineurin activity is necessary and sufficient to push TFEB in the nucleus, where it can complete its function. Nevertheless, calcineurin is known to be active in skeletal muscle during contraction as a consequence of calcium oscillations. For this reason we wondered whether calcineurin activity could affect TFEB translocation also in adult skeletal muscle during exercise. Using muscles transfected with a TFEB-GFP reporter, we demonstrated that calcineurin activity is necessary and sufficient to promote TFEB nuclear translocation even in adult skeletal muscle during coxntraction. However, the physiological meaning of this nuclear translocation in skeletal muscle remained to be addressed. To answer this question we used gain and loss of function approaches, by mean of viral infection of TFEB overesxpressing vectors, muscle specific TFEB knockout animals and tamoxifen inducible muscle specific TFEB transgenic animals. From microarray analysis of muscles overexpressing and lacking TFEB, we realized that the major pathways affected by genetic manipulation are related to mitochondrial biogenesis and function, lipid utilization and glucose homeostasis. Thus we started to dissect the function of TFEB in skeletal muscle proving that its activation is required for mitochondrial biogenesis that is indeed increased in transgenic muscle. We also found an augmented mitochondrial number and size in transgenic muscle, with only a small percentage of dysfunctional mitochondria in KO animals. These changes were paralleled by a TFEB signature in gene expression of genes involved in mitochondrial biogenesis and functionality. Moreover, these morphometric and gene expression evidences correlate with increased mitochondrial respiration and higher activity of respiratory chain complexes. For this reason transgenic muscles produce more ATP than normal mice, while KO muscles have a lower ATP synthesis because mitochondria present a leak in mitochondrial membrane that dissipate membrane potential. Nevertheless, in order to understand if TFEB is able to promote this mitochondrial program independently from PGC1α, we checked the expression of NRF1/2, TFAM and other genes involved in mitochondrial biogenesis in a model of PGC1α ablation during TFEB overexpression. These data, and complexes activity measurements, demonstrate that TFEB is able per se to activate the transcriptional program directly binding to NRF1 and NRF2 genes promoters without the need of the transcriptional co-activator. At this point, we challenged mice with exercise finding that transgenic mice are more resistant to exhaustive contraction than control; conversely muscle specific TFEB-KO animals display pronounced exercise intolerance due to their lack in ATP production. In order to better explain this latter finding, thanks to metabolic measurements we realized that KO muscles rely more on glucose oxidation both in basal condition and during the first phases of exercise thus explaining the observed exercise intolerance triggered by glycogen storage depletion. Furthermore lactate quantification in serum before and after exercise suggests that KO animal depend more on anaerobic glycolysis with respect to control and transgenic counterpart. To deeply investigate the role of glucose oxidation that seems the cause of exercise intolerance, we monitored glycogen levels in muscle of KO animals in resting condition, revealing a reduction of glycogen storage. For this reason after the early stages of exercise TFEB-KO animals need to rapidly shift their metabolism to fatty acid oxidation that however cannot support energy demand because of the presence of dysfunctional mitochondria. Altogether these findings indicate that TFEB is impinging more on metabolism rather than autophagy, that indeed is not affected by TFEB genetic modulation; more in detail TFEB seems to significantly modulate muscular glucose homeostasis that is altered in KO animals. Reduced glucose uptake and glycogen synthesis during EU clamps explains why glycogen storages are depleted in KO animals, while the transgenic counterpart present more glycogen accumulation. This phenotypic effect is paralleled by a change in glucose related genes expression, with higher levels of glucose transporters and glycogen synthesis regulator in transgenic muscles, even in the absence of PGC1α. Nevertheless TFEB overexpression is also able to drive factors such as nNOS and AMPK activity, thus modulating not only the expression but also the signalling pathways related to glucose homeostasis. In conclusion all these findings strongly support a new vision of TFEB as master regulator of metabolic flexibility during physical exercise in a PGC1α-independent fashion.

Il muscolo scheletrico è il tessuto più abbondante dell’organismo e rappresenta più del 40% della massa corporea. Questo organo è responsabile del 30% della spesa energetica a riposo, suggerendo la sua importanza non solo a livello di locomozione ma anche nel controllo del metabolismo a livello sistemico. Infatti il muscolo scheletrico è un tessuto estremamente dinamico, capace di modulare il suo metabolismo in seguito a stimoli di diversa natura. Uno stimolo che attiva maggiori adattamenti metabolici è l’esercizio, che è noto attivare anche l’autofagia. L’esercizio fisico stimola molti effetti benefici sul contenuto e funzionalità mitocondriale, ossidazione degli acidi grassi e assorbimento del glucosio; tuttavia, è considerato uno stimolo che danneggia la normale omeostasi delle fibre muscolari per cui necessita di essere controbilanciato dall’attivazione di meccanismi trascrizionalmente controllati che contrastano gli stress meccanici e metabolici prodotti durante la contrazione. Il ruolo dei fattori di trascrizione FoxO e TFEB nel regolare la degradazione proteica e l’autofagia è largamente conosciuto. Tuttavia, il ruolo di TFEB nel muscolo scheletrico e i suoi possibili effetti nel regolare gli adattamenti derivanti dall’esercizio in questo tessuto non sono ancora chiari. TFEB è stato proposto come fattore chiave nel coordinare autofagia e biogenesi lisosomiale in cellule in coltura, con diverse evidenze che dimostrano la regolazione della sua attività. In particolare è noto come la fosforilazione operata da mTORC1 sia in grado di prevenire l’attivazione di TFEB sequestrandolo nel citoplasma. Tuttavia, non esistono dati riguardanti le possibili fosfatasi coinvolte nell’attivazione di TFEB. Mediante l’utilizzo di uno High Content Screening in grado di monitorare la traslocazione di TFEB nel nucleo durante la starvation, abbiamo identificato il gene PPP3CB, codificante la subunità catalitica della calcineurina, come uno dei migliori geni coinvolti nella rilocalizzazione di TFEB. Abbiamo dimostrato che l’attività della calcineurina è necessaria e sufficiente per spingere TFEB nel nucleo, dove può espletare la sua funzione. Tuttavia, la calcineurina è noto essere attiva nel muscolo scheletrico durante la contrazione come conseguenza dei transienti di calcio. Per questo motivo ci siamo chiesti se l’attività della calcineurina possa influenzare la traslocazione di TFEB nel nucleo anche nel muscolo scheletrico durante l’esercizio fisico. Utilizzando un reporter TFEB-GFP abbiamo dimostrato che l’attività della calcineurina è necessaria e sufficiente a promuovere la traslocazione nucleare di TFEB anche nel muscolo scheletrico durante la contrazione. Tuttavia il significato fisiologico di questo avvenimento rimane da essere spiegato. Per rispondere a questa domanda abbiamo usato degli approcci di gain e loss of function utilizzando infezioni virali con vettori per l’overespressione di TFEB, una linea di topi con delezione muscolo specifica di TFEB e un’altra linea in cui l’overespressione di TFEB può essere attivata in muscolo grazie al tamoxifen. Da uno studio di espressione genica in muscoli overesprimenti TFEB e TFEB deficienti, abbiamo trovato che le vie di segnale principalmente coinvolte dalle manipolazioni genetiche erano quelle correlate alla biogenesi mitocondriale, utilizzo dei lipidi e omeostasi del glucosio. Abbiamo perciò cominciato a dissezionare il ruolo di TFEB nel muscolo scheletrico provando che la sua attivazione è richiesta per la biogenesi mitocondriale, che è per l'appunto aumentata nei muscoli transgenici. Infatti, in questi abbiamo trovato un aumento nel numero e nella dimensione dei mitocondri, mentre abbiamo riportato solo una piccola percentuale di mitocondri disfunzionali nei muscoli knockout. Questi cambiamenti sono accompagnati da un’attivazione dei geni TFEB-dipendenti responsabili per la biogenesi e funzionalità mitocondriale. Inoltre, questi cambiamenti morfometrici e di espressione genica correlano con un aumento nella respirazione mitocondriale e nell’attività dei complessi della catena respiratoria. Per questo motivo i muscoli transgenici producono più ATP dei wildtype, mentre i muscoli KO presentano una ridotta sintesi di ATP a causa di una disfunzionalità della membrana mitocondriale che dissipa il gradiente protonico. Tuttavia, per capire se questi cambiamenti dipendono direttamente da TFEB indipendentemente da PGC1α, abbiamo monitorato l’espressione di NRF1/2, TFAM e altri geni coinvolti nella biogenesi mitocondriale in un modello in cui PGC1α è deleto e TFEB overespresso. Questi dati di espressione uniti alle misure delle attività dei complessi dimostrano che TFEB è in grado di indurre autonomamente la biogenesi mitocondriale legandosi direttamente ai promotori dei geni NRF1 e NRF2. A questo punto abbiamo sottoposto a esercizio i topi riscontrando che gli animali transgenici resistono maggiormente all’attività fisica; al contrario i topi KO presentano una marcata intolleranza all’esercizio a causa della scarsa produzione di ATP. Per spiegare meglio questo fenomeno, grazie a misurazioni di parametri metabolici abbiamo riscontrato che i topi KO fanno affidamento maggiormente nell’ossidazione del glucosio sia a riposo che durante le fasi iniziali dell’esercizio fisico, spiegando l’intolleranza con la fine delle riserve di glicogeno. Inoltre, le quantificazioni del lattato nel siero prima e dopo l’esercizio suggeriscono che i muscoli KO dipendono maggiormente dalla glicolisi anaerobia a differenza delle controparti wildtype e transgenica. A questo punto, per investigare più in dettaglio il ruolo dell’ossidazione del glucosio che sembra essere alla base dell’intolleranza all’esercizio, abbiamo misurato i livelli di glucosio intramuscolare negli animali KO, notando che a riposo questi presentano una riduzione considerevole delle riserve. Per questo motivo gli animali KO, dopo i primi momenti di esercizio, sono costretti a cambiare il loro metabolismo verso una maggiore ossidazione degli acidi grassi che comunque non riesce a supportare la domanda energetica a causa dei mitocondri disfunzionali. Tutte queste evidenze indicano che TFEB controlla più il metabolismo rispetto all’autofagia la quale non è influenzata dalla modulazione genetica di TFEB; più in dettaglio TFEB sembra controllare direttamente il metabolismo del glucosio che è alterato negli animali TFEB-deficienti. Un ridotto assorbimento del glucosio e una ridotta sintesi del glicogeno durante gli EU-clamps spiegano perché le riserve di glicogeno sono ridotte negli animali KO mentre la controparte transgenica ne accumula in più. Questi effetti fenotipici sono accompagnati da un cambiamento nell’espressione di geni connessi all’omeostasi del glucosio, con maggiore presenza di trascritti per i trasportatori di glucosio and regolatori della sintesi del glicogeno nei muscoli transgenici, anche in assenza di PGC1α. Inoltre, l’overespressione di TFEB è in grado di modulare anche l’attività di nNOS e AMPK, influenzando l’omeostasi del glucosio non solo dal punto di visto trascrizionale, ma impattando anche sulle vie di segnale ad esso correlate. In conclusione tutte queste scoperte sostengono fortemente una nuova visione di TFEB come un fattore chiave nella regolazione della flessibilità metabolica durante l’esercizio fisico in modo indipendente da PGC1α.