Structural characterization of proteins involved in Helicobacter pylori motility and adhesion

Helicobacter pylori is a well-known pathogen able to colonize the human stomach of more than half of the world population. Luckely, only the 10% of the affected people manifest severe incidences, like chronic gastritis, peptic ulcers and, among those, only in 1% of cases MALT (Mucosal associated lymphoid tissue) lymphoma and gastric adenocarcinomes are recognized [1]. The project described in this thesis focus mainly on the structural determination and functional characterization of the proteins involved in the assembly of the flagellar architecture. The presence of a flagellate phenotype is paramount for the bacterial colonization processes. Its role is strictly related to the chance of avoiding the acidic milieu in the gas- tric environment and its periodical mechanical clearances, allowing H. pylori to swim through the mucus layer and adhere to gastric epithelial cells [2]. Once the epithelium is reached, the regular colonization process takes place, starting with the adhesion to the cells via a set of adhesines, which cover both the bacterial membrane and flagella [3]. Its propulsion in the motion is guaranteed by a tuft of 5-7 polar flagella, long from 2 to 5 μm, and characterized by a S shape [4]. The flagellum is composed by about thirty proteins that can increase up to hundred considering the components involved in chemotatic and regulatory mechanism [5]. The flagellum is a complex rotary nano-machine, which can be divided in two main components: i) the hook-basal bady portion, where the engine is located; ii) the filament, representing the machinery propeller [6]. During the thesis, the proteins from the hook region of the flagellum and the adhesine recovering the filament were analyzed. The strategy adopted included the amplification of the selected genes from the purified Helicobacter pylori chromosomal DNA (in particular the strains G27 and P12), the cloning in one or two expression vectors, followed by the expression of the protein in E. coli cells and the specific purification from the bacterial lysis supernatant. Unfortunately, the soluble proteins from the hook do not share a significance sequence similarity with any other proteins already known in literature, so their behaviour in solution was not easily predictable. The flagellar proteins analyzed along the work of thesis were: FlgE, FlgE2, FlgK and HpaA (as a flagellar sheath protein). Although all of them were successfully cloned, expressed and purified, only the protein FlgE2 gave sufficiently results to lead to some preliminary structural studies. In chapter 3 the analysis of the flagellar proteins is reported. FlgK is a hook-associated protein involved in the junction between the filament and the hook [7] and FlgE is directly involved in the assembly of the hook [8]. The proteins were characterized in solution and although several crystallization screens were performed, none of them produced crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The most relevant limit was in the production of a large amount of protein, that was eluted as an aggregated form during size-exclution chromatography. The protein FlgE2 is involved in the assembly of the hook as well. It seems to be peculiar for Helicobacter and Campilobater species, but it has not been characterized further. During the thesis, the protein was successfully purified as a monomer and a tetramer. In both the cases, good quality crystals for the X-ray diffraction studies were produced. Several attempts were performed in solving the structure by molecular replacement, using the orthologous from Salmonella typhimurium as template, but none of them was completely successful. However a preliminary model has been designed and is discussed in the chapter. Since the protein does not share a high percentage of similaty with its orthologous proteins, seleniomethionine-labeled protein was produced in order to solve the phase problem and improve the phases obtained by the molecular replacement. The last part of the job is still ongoing. Besides, the functional role of the protein was explored, checking the interaction between the hook structural components and its cognate chaperon, FlgD. The crystal structure of the protein FlgD has been recently solved [9] and demonstrated the presence of a binding site located at the C-terminus. To confirm the binding, a microscale thermophoresis analysis was performed. To achieve the attachment on the epithelial cell, a set of bacterial adhesines are needed and the role of HpaA protein is presented in chapter 4. H. pylori adhesin A is a surface-located lipoprotein that was initially described as a sialic acid binding adhesin, expressed on the surface of gastrointestinal cells [10]. It is supposed to act as a flagellar sheath protein that facilitates the attachment to the cell through flagellar filaments [11]. Owing to its exposed position on the filament, the protein is supposed to be a good candidate as a vaccine target [12]. Due to its high tendency to aggregate, the protein was expressed and purified in a fused form with a super-folder GFP [13]. It produced good quality crystals for X-ray diffraction analysis purpose. However, after the analysis, the crystals resulted to be composed only by sfGFP. The protein HP1457 is related to a different project and it is reported in chapter 5. The protein belongs to a class of proteins that has been recognized, only recently, to act as a outer-membrane proteins that contributes to the stimulation of the peptidoglycan synthase PBP1B [14]. It is enclosed in a translational unit characterized by the presence of genes coding for high immunogenic, secreted proteins, like HP1454 [15], HP1455 (lipoprotein with unknown function) and the protein HP1456, recognized to be a Lpp20 [16]. The protein was fully characterized in solution and several crystallization trials were performed. Unfortunately, none of those led to obtain protein crystals.

Helicobacter pylori é un batterio Gram-negativo presente in piú del 50%della popolazione mondiale. Tuttavia, i ceppi piú aggressivi del batterio colpiscono solo il 10% delle persone affette, causando gastriti croniche e ulcera peptica. Tra queste, solo l’1% manifesta gravi patologie come MALT linfoma ed adenocarcinoma gastrico [1]. Il progetto descritto in questo lavoro di tesi é finalizzato alla determinazione strutturale ed alla caratterizzazione di proteine coinvolte nell’architettura del flagello di H. pylori. Difatti, la presenza del flagello é fondamentale per la colonizzazione da parte del batterio dell’intero ambiente gastrico. Il suo ruole é direttamente collegato all’abilitá del batterio di evitare la permanenza nell’ambiente gastrico, permettengli di attraversare lo strato di muco che aderire all’epitelio gastrico [2]. Grazie ad un set di adesine localizzate sia sulla membrana batterica, sia sui flagelli, H. pylori é in grado di aderire alle cellule epiteliali, cominciando il regolare processo di colonizzazione [3]. Inoltre, la presenza di un seti di 5-7 flagelli polarizzati (lunghi tra 2 e 5 μm) e la sua forma ad S garantiscono al batterio la propulsione e la velocitá necessaria per superare la barriera di muco e raggiungere l’epitelio [4]. In generale, la struttura del flagello é costituita da circa trenta diverse proteine, ma il numero puó crescere fino a cento considerando anche le proteine coinvolte nei meccanismi di chemotassia e di regolazione della crescita del flagello [5]. L’architettura generale del flagello é quella di una una complessa nanomacchina, caratterizzata dalla presenza di due principali componenti: i) la porzione dell’uncino e della parte basale, dove é collocato il motore della stuttura; ii) il filamento, che rappresento il vero propulsore della macchina [6]. Nel corso del progetto di dottorato, sono state analizzate le proteine che costituiscono la regione dell’uncino e ricoprono il filamento. La metodica utilizzata prevede l’amplificazione iniziale dei geni target utilizzando il DNA genomico dei ceppi G27 e P12 come templato. I geni amplificati sono stati inseriti in uno o due vettori di espressione, e le proteine ricombinanti sono state prodotte in colture di E. coli e purificate, tramite diversi metodi cro- matografici, dalla parte solubile della sospensione di lisi batterica. Le proteine dell’uncino di H. pylori non presentano un’elevata similaritá di sequenza con le altre proteine giá riportate in letteratura, pertanto la loro reattivitá in soluzione non é facilmente prevedibili a priori. FlgE, FlgE2, FlgK and HpaA (come proteina di rivestimento del flagello) sono le proteine del flagello analizzate durante questo lavoro di dottorato. Sebbene, tutte siano state clonate, espresse e purificate, solo FlgE2 ha fornito dei risultati sufficienti a condurre degli studi strutturali preliminari. I vari studi condotti sulle proteine del flagello sono riportati nel capitolo 3. FlgK é defina una hook-associated protein, che funge da giuntura tra il filamento e l’uncino [7], mentre FlgE é direttamente coinvolta nella polimerizzazione dell’uncino [8]. Entrambe le proteine sono state ampiamente caratterizzate in soluzione ma, sebbene siano stati preparati numerosi screen di cristallizzazione, nessuna delle due ha portato ad ottenere cristalli analizzabili tramite diffrazione a raggi-X. Il limite maggiore osservato nella produzione delle due proteine é l’eluizione di una grande quantitá di forma aggregata, durante il processo di purificazione via cromatografia ad esclusione dimensionale. Anche la proteina FlgE2 é coinvolta nel processo di polimerizzazione dell’uncino. Tuttavia questa sembra essere peculiare solo per le specie batteriche di Helicobacter e Campilobacter e, pertanto, non si hanno numerosi informazioni a riguardo. Durante il lavoro di tesi, la proteina é stata purificata sia in forma monomerica che in forma tetramerica e, in entrambi i casi, sono stati ottenuti cristalli analizzabili tramite diffrazione da raggi-X. Tuttavia, molti tentavi sono stati svolti per risolvera la struttura tramite molecular replacement, utilizzando come templato la struttura della proteina ortologa di Salmonella typhimurium, ma nessuno di questo ha avuto interamente successo. Tuttavia, é stato possibile descrivere un modello preliminario, che verrá successivamente discusso all’interno del capitolo. Poiché HpFlgE2 non presenta un’elevata similaritá con StFlgE2, é stata prodotta una variante in cui sono state sostituite le metionine con seleniometionine; in questo modo si é provato a migliorare calcolando le fasi relative agli atomi pesanti (Se) e successivamente espandendole tramite i dati raccolti per la proteina nativa. Quest’ultima parte del lavora é ancora in via di definizione. Inoltre, date le scarse conoscenze riportate in letteratura riguardanti la proteina, si é cercato di definirne la reale funzione a partire dall’interazione con lo specifico chaperone FlgD. La struttura cristallografica della proteina FlgD é stata risolta recentement [9], rivelando la presenza di un motivo lineare collocato nella parte C-terminale, rappresentativo di una zona di legame con la proteina coniugata. Il legame é stato confermato tramite termoforesi in microscala. Per potersi legare alle cellule epitaliali, H. pylori ha bisogno di un set di proteine (ade-sine) che ne permettano l’adesione. La proteina HpaA (Helicobater pylori adhesine A),analizzata nel capitolo 4, é una lipoproteina, localizzata sulla superfice del flagello ed inizialmente é stata ipotizzata affine all’acido sialico, esposto sulla superficie delle cellule gastriche [10]. Si suppone che la proteina possa operare come proteina di rivestimento delflagello e che faciliti il legame sulla superficie delle cellule attraverso l’adesione dei flagelli[11]. Inoltre, data la sua posizione esposta, HpaA é stata considerato un ipotetico target per lo svilluppo di vaccini [12]. Infine, la proteina da sola presenta un’elevata tendenza a creare degli aggreagati in soluzione, pertanto é stata espressa e purificata in fusione con una super-folder GFP [13]. La proteina é stata successivamente cristallizata ed é stata analizzata tramite diffrazioni da raggi-X. Sfortunatamente, l’analisi dei dati di diffrazione ha portato alla conclusione che i cristalli erano formati esclusivamente da sfGFP. Infine, nel capitolo 5 viene analizzata la proteina HP1457. Questa appartiene ad una classe di proteina recentemente riconusciute operare come outer-membrane proteine, coinvolte nella stimolazione della peptidoglicano-sintasi, PBP1B [14]. Inoltre, la proteina HP1457 appartiene ad un operone caratterizzato dalla presenza di geni che codificano per proteine di secrezione altamente immunogeniche. Tra queste: HP1454 [15], HP1455 (una lipoproteina di funzione ancora sconosciuta), HP1456 (identificata come la lipoproteina Lpp20) [16]. HP1457 é stata ampiamente caratterizzata in soluzione e sono stati effettuati numerosi tentativi di cristallizzazione su diversi costrutti, ma nessuno di questi ha portato ad ottenere cristalli.