The Mitochondria Fission Protein DRP1 is Required for Muscle Mass Maintenance

The skeletal muscle accounts for almost 40% of total body mass and represents a major site of metabolic activity. Skeletal muscle is a dynamic tissue: exercise and hormonal stimulation lead to an increase in protein synthesis and fiber size, a process called hypertrophy. Conversely, the loss of muscle mass, named atrophy, is the result of an increase in protein degradation. Muscle atrophy can occur in several pathological conditions like cancer, diabetes, chronic heart failure, AIDS, and during aging. Mitochondria play a key role in muscle homeostasis, because they provide its high energy demand. Indeed, atrophying conditions are characterized by alterations of the mitochondrial network (Romanello et al., 2010). So, the maintenance of a functional mitochondrial population is important for tissues that are highly structured and metabolically active such as neurons, cardiac and skeletal muscle. In these tissues, mitochondria quality control depends only on mitochondria shaping machinery which include fusion and fission processes. Mitochondrial fusion leads to the formation of an interconnected network, facilitating the redistribution of metabolites, proteins and mtDNA. On the contrary, fission generates isolated and fragmented mitochondria allowing the specific removal of dysfunctional and damaged organelles via mitophagy. The importance of mitochondria fusion and fission in skeletal muscles was underlined by transcriptomic and proteomic analysis showing the progressive loss during ageing of mitochondrial proteins involved in these mechanisms (Ibedunjo et al., 2013). The key player of mitochondria fission is Dynamin Related protein-1, Drp1, a cytosolic guanosine triphosphatase (GTPase) that is recruited to the outer mitochondria membrane (OMM) of damaged mitochondria, where it assembles into multimeric ring complexes inducing mitochondria fragmentation (Smirnova et al., 2001). Recent findings indicate that muscle-specific Drp1 overexpression triggers muscle mass loss and decreases exercise performance (Touvier et al., 2015), confirming previous data demonstrating that overexpression of the fission machinery in skeletal muscle is sufficient to induce mitochondrial dysfunction and muscle atrophy (Romanello et al., 2010). Since overexpression studies are often confounded by off target effects, we decided to use a loss of function approach to study the role of Drp1 in skeletal muscle mass maintenance. Therefore, we generated a muscle-specific Drp1 knock-out mouse model (MLC1f-Drp1 KO). The conditional deletion of Drp1 resulted in a lethal phenotype and an important muscle atrophy. Muscle mass loss is mediated by a decrease in protein synthesis mainly due to the activation of Unfolded Protein Response (UPR) pathway that blocks general translation through eif2α phosphorylation. UPR led also to the up-regulation in skeletal muscle of the cytokine FGF21. The observed FGF21 induction resulted in metabolic changes such as hypoglycemia, growth hormone (GH) resistance and decreased insulin-like growth factor IGF-1 expression in the liver, and a consequent reduced animal size. In addition, Drp1 ablation triggered protein degradation through the induction of FoxO3, a major regulator of protein breakdown. In particular, FoxO3 is the responsible of the increased expression of Atrogin1 and MuRF1, two muscle-specific E3 ubiquitin-ligases, and MUSA1, a novel ubiquitin-ligase, meaning that the Ubiquitin-Proteasome system is activated in knock-out animals. Moreover, real-time PCR analyses revealed the induction of several genes implicated in different step of the autophagic flux, suggesting that also Autophagy-Lysosome system contributes to protein degradation in MLC1f-Drp1 knock-out. Considering the severity of the phenotype, we decided to investigate the role of Drp1 in adult muscles through the generation of muscle-specific inducible Drp1 knock-out mice (HSA-Drp1 KO). We surprisingly found that Drp1 deletion in adulthood resulted in body weight loss secondary to muscle atrophy. Moreover, knock-out mice appeared weaker compared to controls. Indeed, both absolute and normalized force were affected in Drp1-deleted animals, suggesting that muscle weakness was not dependent on muscle atrophy. In addition, the absence of mitochondria division impaired mitochondria size and morphology leading to the presence of enlarged mitochondria with a reduced functionality. In fact, mitochondria membrane potential and respiration efficiency were affected in HSA-Drp1 KO muscles. In order to explain the mechanism involved in muscle atrophy, we found that the activation of UPR pathway, and of degradative systems involved in protein breakdown are conserved between conditional and inducible models. However, in vivo protein synthesis rate is not affected during adulthood. Muscle weakness, UPR activation and mitochondria dysfunction can be triggered by an impairment in calcium physiology. We analyzed calcium homeostasis in flexor digitorum brevis (FDB)-isolated fibers and found that the deletion of Drp1 impaired sarcoplasmic reticulum (SR)-calcium release, which is prevented by the inhibition of mitochondrial calcium uptake through mitochondrial calcium uniporter (MCU) silencing. Importantly, these alterations precede muscle mass loss, suggesting that dysregulation of calcium homeostasis can be the cause of the severe phenotype. These findings indicate that mitochondrial dynamics and mophology are important for the maintenance of the physiology of calcium signaling at least in skeletal muscle. Finally, knock-out mice analyzed after 7 months from Drp1 deletion showed signs of precocious aging and a severe muscle mass loss. Moreover, the chronic Drp1 ablation led to myofibers degeneration and regeneration, as shown by the accumulation of centrally nucleated fibers. All together, our results, strongly support the involvement of mitochondrial morphology and/or function in the activation of signaling pathways that control muscle mass. Thus, therapeutic interventions that maintain a fine equilibrium of mitochondrial fusion/fission processes in needed to preserve muscle mass and prevent muscle wasting.

I muscoli scheletrici costituiscono il 40% di tutto l’organismo e sono caratterizzati da un’elevata attività metabolica. Il muscolo scheletrico è un tessuto molto plastico e dinamico che adatta la propria massa in risposta a diversi stimoli. L’esercizio fisico e gli stimoli anabolici, per esempio, inducono un aumento della sintesi proteica e della massa muscolare, un processo chiamato ipertrofia. Un aumento della degradazione proteica, invece, provoca perdita della massa muscolare, detta atrofia. L’atrofia muscolare è una conseguenza di diverse condizioni patologiche come cancro, diabete, AIDS, cardiomiopatie ed invecchiamento. I mitocondri hanno un ruolo chiave nel mantenimento dell’omeostasi muscolare in quanto forniscono l’energia necessaria al muscolo. Infatti, l’atrofia muscolare è caratterizzata da alterazioni nel network mitocondriale (Romanello et al., 2010). Per questo motivo, è particolarmente importante preservare la funzionalità mitocondriale nei tessuti caratterizzati da un’elevata attività metabolica come neuroni, muscoli scheletrico e cardiaco. In questi tessuti, il controllo della funzionalità dei mitocondri è esclusivamente basato sui processi di fusione e fissione mitocondriale. La fusione mitocondriale aumenta la connessione tra i mitocondri in modo da favorire lo scambio di proteine, metaboliti e DNA mitocondriale. La fissione, invece, porta alla frammentazione di questi organelli permettendo, così, la rimozione dei mitocondri disfunzionanti attraverso un meccanismo chiamato mitofagia. L’importanza di questi due processi nel muscolo scheletrico è stata recentemente evidenziata da analisi di trascrittomica e di proteomica, i quali hanno dimostrato la progressiva perdita, durante l’invecchiamento, di proteine mitocondriali coinvolte nei meccanismi di fusione e fissione (Ibedunjo et al., 2013). Drp1, una proteina appartenente alla famiglia delle GTPasi, ha un ruolo chiave nella fissione mitocondriale. In particolare, Drp1 è una proteina citosolica che trasloca sulla membrana mitocondriale esterna dei mitocondri danneggiati e disfunzionanti, dove si assembla formando un anello multimerico che induce la divisione mitocondriale (Smirnova et al., 2001). Recentemente alcuni studi hanno dimostrato che l’overespressione di Drp1 nel muscolo induce perdita della massa muscolare e riduce la performance durante l’esercizio fisico (Touvier et al., 2015). Ciò conferma alcuni dati ottenuti precedentemente, i quali dimostrano che l’aumentata espressione nel muscolo scheletrico di altre proteine coinvolte nella fissione mitocondriale, inducono atrofia muscolare ed una diminuita funzionalità dei mitocondri (Romanello et al., 2010). Purtroppo, gli studi basati sulla tecnica dell’overespressione di proteine sono spesso accompagnati da effetti secondari, perciò abbiamo deciso di studiare il ruolo di Drp1 nel muscolo scheletrico utilizzando un approcio di tipo loss of function. Abbiamo, quindi, generato un modello di topo Drp1 knock-out muscolo-specifico (MLC1f-Drp1 KO). La delezione di Drp1 nel muscolo è risultata essere letale e causa atrofia muscolare. La perdita della massa muscolare è mediata da una riduzione della sintesi proteica, che è dovuta all’attivazione della via di segnale UPR. La via UPR, infatti, blocca la sintesi proteica attraverso la fosforilazione del fattore eif2α. Inoltre, la via UPR induce un aumento dei livelli di espressione della citochina FGF21 nel muscolo scheletrico. L’induzione di FGF21 determina alcuni importanti cambiamenti nel metabolismo degli animali knock-out: ipoglicemia, resistenza all’ormone della crescita e diminuzione dell’espressione di IGF-1 nel fegato. Questi cambiamenti sono responsabili del fatto che gli animali Drp1-deleti appaiono più piccoli rispetto ai controlli. La mancata espressione di Drp1 nel muscolo induce anche un aumento nella degradazione delle proteine attraverso FoxO3. FoxO3 è un fattore che controlla le vie degradative nel muscolo scheletrico. In particolare, FoxO3 induce l’espressione di Atrogin1 e MuRF1, due ubiquitine ligasi muscolo-specifiche, e di MUSA1, un’ubiquitina ligasi recentemente identificata nel nostro laboratorio (Sartori et al., 2013). Questi dati dimostrano l’attivazione del sistema ubiquitina-proteasoma nei muscoli degli animali knock-out. Inoltre, l’analisi attraverso real-time PCR di alcuni geni coinvolti in diversi step del flusso autofagico, suggerisce che anche l’attivazione del sistema autofagia-lisosoma contribuisce alla degradazione proteica nel nostro modello animale. Considerando che la delezione di Drp1 induce la morte precoce dell’animale, abbiamo deciso di studiare il suo ruolo nel muscolo adulto attraverso la generazione di un modello knock-out inducibile muscolo-specifico (HSA-Drp1 KO). Sorprendentemente, la delezione di Drp1 in età adulta provoca una significativa perdita di peso corporeo a causa della riduzione della massa muscolare. Inoltre, i topi knock-out appaiono più deboli in quanto sia la forza assoluta, sia la forza normalizzata, sono più basse rispetto ai controlli. Ciò suggerisce che la diminuzione della forza è indipendente dall’atrofia. L’assenza della divisione mitocondriale impatta anche sulla dimensione e sulla morfologia dei mitocondri, portando all’accumulo di mitocondri più grandi, ma con una diminuita funzionalità. Infatti, i mitocondri nei muscoli knock-out sono caratterizzati da alterazioni nel mantenimento del potenziale di membrana e una ridotta efficienza respiratoria. Studiando i meccanismi coinvolti nell’atrofia muscolare, abbiamo notato che la via di segnale UPR e i sistemi di degradazione (Ubiquitina-Proteasoma e Autofagia-Lisosoma) sono conservati nei due modelli animali. Tuttavia, la sintesi proteica non risulta alterata in età adulta. La ridotta forza muscolare, l’attivazione della via UPR e la disfunzione mitocondriale possono essere dovute ad una alterazione della fisiologia del calcio. Per questo motivo, abbiamo analizzato l’omeostasi del calcio nelle fibre muscolari derivate dal muscolo FDB. I risultati dimostrano che la delezione di Drp1 altera il rilascio di calcio dal reticolo sarcoplasmatico. Ciò si può prevenire inibendo l’ingresso di calcio nei mitocondri, attraverso il silenziamento di MCU. È interessante notare che queste alterazioni precedono la perdita della massa muscolare, suggerendo che esse possano essere la causa del fenotipo osservato. Questi risultati indicano che la dinamica e la morfologia mitocondriali potrebbero influenzare in parte il controllo dei livelli di calcio nel muscolo scheletrico. Infine, gli animali knock-out, analizzati 7 mesi dopo la delezione di Drp1, mostrano segni di invecchiamento precoce e una grave atrofia muscolare. Inoltre, i muscoli sono caratterizzati da degenerazione e rigenerazione delle fibre muscolari, come evidenzia l’accumulo di fibre centro-nucleate. Riassumendo, i nostri risultati dimostrano che la morfologia e la funzione dei mitocondri influenzano l’attivazione di vie di segnale che controllano la massa muscolare. Interventi terapeutici mirati a mantenere l’equilibrio dei processi di fusione e fissione mitocondriali possono, perciò, essere di fondamentale importanza per preservare la massa muscolare e prevenire l’atrofia.