Unlocking new molecular mechanisms and potential therapeutic targets for chronic lymphocytic leukemia

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) represents the most common leukemia in the Western world. It is characterized by a neoplastic clonal expansion of CD5 B lymphocytes. Deletion of the chromosomal 13q14 is the most frequent chromosomal aberration in CLL, but how it contributes to CLL pathogenesis and outcome of disease is still unclear. miR-15a and miR-16-1, located in the 13q14 region, are important for regulating levels of TP53 transcript and protein, As TP53 is a negative regulator of TERT, the catalytic component of telomerase, we hypotized that levels of TERT, are correlated with levels of miR-15a/16-1 and TP53. During first part of my PhD thesis, we characterized CLL cases, with the sole 13q14 deletion and with no chromosomal abnormalities, for miR-15a/16-1, TP53 and TERT expression. We found that levels of miR-15a and miR-16-1 were significantly lower in 13q14del CLL than in CLL with no chromosomal abnormalities and both miRNAs levels inversely correlated with TP53 expression. TERT levels inversely correlated with TP53 levels in 13q14del CLL, but not in CLL with normal cytogenetic profile and were significantly lower in the former group of CLL than in the latter one. Notably, disease progression was more rapid in both group of CLL with high TERT levels (>median), whereas high TP53 levels (>median) conferred better clinical outcome only in the subgroup of 13q14del CLL. Within the 13q14del CLL, TERT/ TP53 level profile identified subgroups of patients with different clinical outcomes. Within the 13q14del CLL, high TERT/low TP53 level profile is an independent marker of worse clinical outcome. Overall, these data indicate that in 13q14del CLL, the miR-15a/miR-16-1 and TP53 axis may be an important pathway regulating telomerase expression, and TERT/TP53 profile may be particularly useful in refining the prognosis of patients with 13q14del CLL. Relevant proportion of CLL patients show biochemical and functional features of anergic B cells, characterized by the lack of signalling capacity and constitutive activation of ERK1/2. Anergy is the mechanisms that the immune system adopts to silence autoreactive B lymphocytes. Therefore, it is reasonable to suggest that reversing the anergic state of these CLL might be beneficial in terms of clinical responses. The aim of my PhD studies, regarding search for new therapeutic strategies, was to evaluate the therapeutic potential of agents that target ERK activity in CLL, in vitro and in vivo. MEK1/2 inhibitor Trametinib was recently approved as a single-agent for the treatment of metastatic melanoma. During my stay at San Raffaele Institute, we preliminarily showed that in preclinical models (both in vitro and in vivo) a therapeutic effect can be observed when targeting the MAPK pathway, constitutively active in anergic B cells and in a subset of CLL patients. In particular, we showed that treatment with Trametinib significantly reduces the survival of a series of pERK(+) cell lines, human primary CLL and TCL1 mouse leukemic cells in vitro. We have also studied if Trametinib would potentiate the cytotoxic activity of BTK inhibitor Ibrutinib, both in vitro and in vivo, though with no success. Our data underscored the relevance of the anergic pathway as a potential therapeutic target in CLL.

La leucemia linfatica cronica (LLC) rappresenta la leucemia più comune nel mondo occidentale. Essa è caratterizzata da una espansione clonale neoplastica di linfociti CD5 B. La delezione cromosomica 13q14 è l'aberrazione cromosomica più frequente nella LLC, ma come essa contribuisce alla patogenesi della LLC e l'esito della malattia è ancora poco chiaro. I miR-15a e miR-16-1, situati nella regione 13q14, sono importanti per la regolazione dei livelli di TP53, sia del trascritto sia della proteina. Essendo TP53 un regolatore negativo di TERT, il componente catalitico della telomerasi, abbiamo ipotizzato che i livelli di TERT sono correlati con i livelli di miR-15a / 16-1 e TP53. Durante la prima parte della mia tesi di dottorato, abbiamo caratterizzato i casi di LLC con la sola delezione 13q14 e senza anomalie cromosomiche, per l’espressione di miR-15a / 16-1, TP53 e TERT. Abbiamo scoperto che i livelli di miR-15a e miR-16-1 erano significativamente più bassi nei casi di LLC deleti rispetto ai casi di LLC senza anomalie cromosomiche. Inoltre i livelli di entrambi i miRNA erano inversamente correlati con l'espressione TP53. I livelli di TERT erano inversamente correlati con i livelli di TP53 solo nei casi 13q14del, ma non nei casi di LLC con il normale profilo citogenetico, e sono risultati significativamente più bassi nel primo gruppo di pazienti che in questi ultimi casi. In particolare, la progressione della malattia è stata più rapida in entrambi i gruppi di LLC con livelli di TERT elevati (> mediana), mentre i livelli TP53 elevati (> mediani) hanno conferito un migliore risultato clinico solo nel sottogruppo di 13q14del CLL. All'interno dei casi di LLC 13q14del, il profilo dei livelli di TERT/TP53 ha identificato sottogruppi di pazienti con differenti esiti clinici. In particolare in questo gruppo di pazienti il profilo costituito da alto livello di TERT / basso livello TP53 è un indicatore indipendente di un peggiore clinical outcome. Nel complesso questi dati indicano che nei casi di LLC con la delezione 13q14, il miR-15a / miR-16-1 e l'asse TP53 possono costituire un pathway importante che regola l'espressione della telomerasi; inoltre il profilo TERT può essere particolarmente utile nel perfezionare la prognosi dei pazienti affetti da leucemia linfocitica cronica 13q14del. Una proporzione rilevante di pazienti affetti da LLC mostra caratteristiche biochimiche e funzionali proprie delle cellule B anergiche, caratterizzate dalla mancanza di capacità e dall'attivazione costitutiva di ERK1/2. L’ anergia è un meccanismo che il sistema immunitario adotta per mettere a tacere i linfociti B autoreattivi. Pertanto, è ragionevole pensare che invertire lo stato anergico di questi LLC potrebbe essere vantaggioso in termini di risposta clinica. Lo scopo dei miei studi di dottorato, per quanto riguarda ricerca di nuove strategie terapeutiche, è stato quello di valutare il potenziale terapeutico di agenti che colpiscono l'attività di ERK nella LLC, sia in vitro sia in vivo. L’inibitore di MEK1/2 trametinib è stato recentemente approvato come singolo agente per il trattamento del melanoma metastatico. Durante il mio soggiorno al San Raffaele, abbiamo ottenuto dati preliminari che mostrano come attraverso il targeting del pathway di MAPK, costitutivamente attivo nelle cellule B anergiche, sia possibile ottenere un effetto terapeuticoe in modelli preclinici (sia in vitro sia in vivo) e in un sottogruppo di pazienti affetti da LLC. In particolare, abbiamo mostrato che il trattamento con trametinib riduce significativamente la sopravvivenza in vitro di una serie di linee cellulari pERK(+), di cellule primarie di LLC e di cellule leucemiche murine (TCL-1). Abbiamo anche studiato se trametinib sia in grado di potenziare l'attività citotossica dell’inibitore di BTK Ibrutinib, sia in vitro sia in vivo, ma senza successo. I nostri dati hanno sottolineato l'importanza del pathway dell’anergia come un potenziale target terapeutico nella LLC.