CARBONIC ANHYDRASE AND GLUTATHIONE PEROXIDASE. MOLECULAR PHYLOGENESIS AND PHYSIOLOGICAL IMPORTANCE FOR ENVIRONMENTAL STRESS RESISTANCE

Glutathione peroxidase (GPX, EC 1.11.1.9 and EC 1.11.1.12) and Carbonic anhydrase (CA, EC 4.2.1.1) are two enzymes important for a variety of adaptation/tolerance processes of organisms. CA plays a key role in osmoregulation when GPX is one of the most important enzymes involved in protection of the organism against oxidative damage. In my thesis I studied GPX and CAs from Antarctic teleosts species of Notothenidae and Bathydraconidae (Paper I-II) and CAs from intertidal teleosts (Periophtalmus sobrinus, Gobidae, and Opsanus beta, Batrachoididae (Paper II-III). Firstly, I compared the obtained sequences with those available in database for teleosts and other vertebrates (human, mouse and bird) to reconstruct the molecular phylogeny of two enzyme in teleosts (Paper I-II). Finally, I have investigated the role of CA for the osmoregulation in seawater toadfish (Opsanus beta) exposed to hypersalinity (Paper III). The GenBank database, few sequences of GPX and CAs of temperate teleosts are available and no data are available for Antarctic or intertidal fish were not present. In particular, I choose to study those species because they live in environments with peculiar chemical/physical parameters that influenced, during the evolution, their physiological, morphological and behavioural characteristics. The Antarctic fish (Papers I-II) live in a well delimited geographic zone. The Southern Ocean is comprised from the Antarctic continent to the Polar Front, a curved current continuously encircling Antarctica where cold, northward-flowing Antarctic waters meet and mix with the relatively warmer sub-Antarctic waters. In this limited zone, macro evolutionary events happened, such as radiation of some fauna components. Most of the fish species living in this zone (like nototenioidae) are presents only there. Temperature (-1.9 °C) and salinity (34.8 ppt) are lower than in temperate Oceans (Legg et al. 2009). As a consequence, the oxygen concentration is higher (9 mg l-1 (Meiner et al. 2009)) in these waters because of the higher solubility of the gas. Furthermore, these parameters are constant during the year. In this perspective, is high the interest to study the evolution of some proteins such as of GPX (Paper I), linked to hyperoxia, and of CAs (Paper II), linked to osmoregulation, to investigate if two enzymes have been an independent evolution and if them aminoacidic sequences are modified compared to sequences of temperate teleosts. The intertidal species (mudskipper Periophtalmus sobrinus (Paper II) and toadfish Opsanus beta (Paper III) both live in mangrove zones. Temperature (the average 28.9°C in Kenya (Schmitz et al. 2007) and in 25.8°C Florida (Kelble et al. 2007)) and salinity (the average 32.4 ppt in Kenya (Schmitz et al. 2007) and 33.0 ppt in Florida (Kelble et al. 2007)) are higher with respect to temperate oceans and these parameters, in contrast to Antarctic habitat, are very fluctuating. Gazy Bay (Kenya), where mudskipper lives, is subject to seasonal fluctuation due to tides. Florida Bay (Florida), where toadfish lives, is subject to seasonal fluctuation due to wet and dry season. The mudskipper was sampled in Gazy Bay (during summer of 2007), and toadfish was sampled in Florida Bay (during summer of 2009). My data show that both GPXs and CAs aminoacidic sequences are conserved in all teleosts (Paper I-II). Just a few aminoacidic changes were found in Antarctic teleosts aminoacidic sequences. Considering the active site and he aminoacidic zone toward the catalytic centre of GPX (Paper I), only the polar Arg182, conserved in all teleosts GPX-1, changes in a hydrophobic Lys in Antarctic fish enzyme (Aumann et al. 1997). In CA sequences the analysis has been focused on residues that are included within 10 Å of the zinc atom (Paper II). They are almost all conserved, with only a few aminoacidic substitutions but maintaining the same properties. Consequently we assume that the features of active site and the aminoacidic sequence toward the catalytic centre of both enzymes are well conserved in teleosts. The phylogenetic tree has different topology for GPX and CA sequences (Paper I-II). In the GPX the Antarctic teleosts group together, while in the CA tree they are divided in two different groups. The topology of GPX of Antarctic teleosts is the same as that of Antarctic teleosts obtained by molecular data (16S rRNA. (Near et al. 2004). This suggests that the CAs evolved in a separate way. In the last paper (Paper III), I measured the expression and activity of CA linked to osmoregulation. It was not possible to perform the same analysis for GPXs and CAs of other fish sequenced because the samples used were frozen while to measure activity I needed fresh samples. I found a correlation between hypersalinity and increase of CA activity and expression in gills and intestine. This suggests an involvement of gill and intestine CA in regulation of seawater fish exposed to hypersalinity

I pesci vivono negli habitat più diversi: acque dolci (fino a 0,01 ppt), salate (fino a 100 ppt), stagnanti; in zone al di sopra dei 5.200 metri (Kottelat and Chu 1988) o nelle profondità abissali di 7000 metri (Nelson 1994). Alcuni vivono in zone soggette a forti maree e tollerano brevi escursioni sulla terraferma (Sayer 2005), altri resistono a temperature di circa 44°C (es. Tilapia in Africa) o di circa -2°C (es. Trematomus nelle acque antartiche) (Nelson 1994). Per vivere e riprodursi in ambienti tanto diversi hanno sviluppato una serie di adattamenti fisiologici, morfologici e comportamentali. Il mio progetto di dottorato si è concentrato su due linee di ricerca: la filogenesi molecolare di due enzimi, la Carbonico anidrasi (CA, EC 4.2.1.1) e la Glutatione perossidasi (GPX, EC 1.11.1.9 e 1.11.1.12) di specie antartiche e intertidali; il coinvolgimento della CA nell’adattamento a condizioni di ipersalinità in una specie di teleosteo della zona intertidale. I pesci antartici vivono in acque molto fredde, vicine al punto di congelamento (-1,8 °C), e con una concentrazione salina molto bassa (34,8 ppt) (Nelson 1994). Questi parametri si collocano all’estremo inferiore della scala di temperature e salinità delle acque dove vivono pesci di mare aperto la temperatura nelle acque temperate è di circa 20°C e la salinità è intorno a 40 ppt (Nelson 1994)- ma sono molto stabili anche nel periodo annuale. La zona di mare dove vivono questi organismi rappresenta una sorta di microambiente con minime variazioni (Eastman 2005). Una conseguenza diretta dei bassi valori di temperatura e salinità è una concentrazione di ossigeno molto più elevata nel caso delle acque antartiche rispetto a quelle temperate (valori nelle acque antartiche i valori vanno da un minimo di 159 a un massimo di 413 μmol/Kg (Meiner et al. 2009) mentre nelle acque temperate il minimo registrato e <20 μmol/Kg (Fuenzalida et al. 2009)). La zona di acqua costiera dove vivono questi organismi, è circondata dalla corrente circumpolare antartica, formatasi circa 22-25 milioni di anni fa in seguito a una serie di movimenti tettonici e oceanografici, che crea una naturale barriera attraverso la quale i pesci non possono passare.(Eastman 2005) Si è formato cosi un unico sito dove si sono create delle nuove nicchie ecologiche occupate da gruppi di pesci (i Nototenoidei) che si sono sviluppati in situ.(Anderson 1999) I pesci studiati sono Trematomus bernacchii, T. eulepidotus, T. lepidorinus e Cygnodraco mawsoni, appartenenti alla famiglia dei notetioneidei, la fauna maggiormente rappresentata in termini di diversità, abbondanza e biomassa nell’Oceano Antartico (Eastman 1993). I membri di questa famiglia sono caratterizzati da diversi adattamenti fisiologici (ad es. le proteine antigelo) (Chen et al., 1997; Cheng C-HC, 2002)) e da un alto grado di diversità morfologica (Eastman 2000; Kock 1992) che li rendono adatti a sopravvivere in queste acque. I Nototenioidei sono endemici in Antartide ed è stato ipotizzato che rappresentino una radiazione adattativa avvenuta nell’Oceano Antartico (Briggs 1974; Briggs 1996) Esistono 8 famiglie di Nototenioidei per un totale di 44 generi e 129 specie. Di queste, 101 sono prettamente antartiche e solo 28 sono non antartiche (Bargelloni et al., 2000; Stankovic et al., 2002; Near et al., 2004). La zona di mangrovia è situata tra mare e terra nella zona intertidale. La collocazione geografica di questo biotopo implica elevate temperature e di conseguenza la concentrazione di ossigeno disciolto e la salinità fluttuano ampiamente durante il corso della giornata per effetto combinato delle maree e della evaporazione dell’acqua (Blaber 1997; Lowe-McConell 1987; Morton 1989). Elevata salinità, elevate temperature e l’istaurarsi di condizioni di anaerobiosi nell’acqua sono le caratteristiche peculiari di questa zona (Kathiresan 2001). La maggior parte di pesci intertidali di questi areali, mostrano diversi adattamenti di tipo fisiologico, morfologico e comportamentale (Bridges 1993; Gibson 1996; Lewis 1970). I mudskippers sono un gruppo di teleostei (Perciformes, Gobiidae, Oxudercinae) che vive tra le mangrovie; sono eurialini e adattati a cambiamenti estremi di salinità (Chew and Ip 1990), esposizione all’aria (Kok et al. 1998) ipossia (Chew SF 1990), e ad alte concentrazioni di ammonio (Ip et al. 2004). I mudskippers appartengono al gruppo monofiletico dei gobioidei (Thacker 2009; Winterbottom 1993) che ha subito una radiazione nel passaggio all’habitat marino. L’Opsanus beta (Gulf toadfish) è un teleosteo marino distribuito lungo le coste tra il Golfo del Messico e il Sud America. Vive in acque stagnanti dove vi è un continuo mescolamento di acqua salata e acqua dolce. La continua evaporazione crea un ambiente con salinità fluttuante (Lirman and Cropper 2003); ad esempio le medie di salinità calcolate nella zona di Florida Bay vanno da un minimo di 24.2 ppt in novembre a un massimo di 41.8 ppt in luglio (Kelble et al. 2007). Il toadfish tollera salinità che vanno da 5 a 60 ppt in condizioni di laboratorio (McDonald and Grosell 2006). All’aumentare della salinità si osserva un aumento della richiesta di assorbimento di sale dall’intestino; questo ha un significativo impatto sul bilancio acido-base dovuto al cambiamento nell’escrezione di CO2 nell’intestino (Genz et al. 2008). La Glutatione Perossidasi La Glutatione perossidasi GPX) è una famiglia di isozimi che catalizzano la riduzione degli idroperrosidi organici ad acqua, o alla corrispondente sostanza alcolica, usando il glutatione ridotto (GSH) come donatore di elettroni. Di questo enzima, che può essere seleno-dipendente o indipendente, ne sono state caratterizzate 4 diverse isoforme: GPX1 localizzata in fegato, polmoni e reni, GPX2 gastrointestinale, GPX3 trovata in reni, polmoni, epididimo, vasi deferenti, placenta, vescicole seminali,cuore e muscolo e GPX4 (fosfolipidica) distribuita largamente nei tessuti (Hochachka and Lutz, 2001; Margis et al., 2008). L’importanza della GPX è di preservare le cellule dai possibili danni dovuti alla produzione di H2O2 prodotto nei mitocondri come conseguenza della fosforilazione ossidativa. In diversi siti lungo la catena respiratoria mitocondriale, l’ossigeno subisce una riduzione parziale, generando l’anione superossido che è il primo di una serie di radicali (O2-), il radicale idrossilico (OH∙), l’ossigeno singoletto (1O2) e il perossido di idrogeno (H2O2)) (Miller 1993b). I radicali prodotti (ROS, reactive oxigen species) interagendo con diversi target intracellulari (lipidi, proteine e acidi nucleici) attivano meccanismi di morte cellulare e inducono varie disfunzioni cellulari ritenute responsabili di molteplici patologie. In condizioni di ipossia o iperossia la produzione di ROS è maggiore (Fink and Scandalios 2002). La Carbonico Anidrasi La carbonico anidrasi riveste un ruolo fondamentale nella reazione reversibile di idratazione, deidratazione della CO2 con produzione di H+ e HCO3– (CO2+H2O→H++HCO3-). La funzione principale della CA è la regolazione acido-base e l’osmoregolazione a livello intestinale e branchiale (Geers and Gros, 2000; Esbaugh and Tufts, 2006). La CA dei pesci studiati, probabilmente, ha sviluppato un particolare adattamento, legato all’osmoregolazione, dovuto agli ambienti ipo (oceano Antartico) e ipersalino (zona intertidale) in cui vivono. Nei mammiferi si conoscono 16 differenti isozimi che differiscono per proprietà cinetiche, distribuzione tissutale e localizzazione subcellulare. Le diverse isoforme della famiglia delle α-CA sono la I, II, III, V, VII and XIII citoplasmatiche, la IV, IX, XII,XIV, XV legate in membrana (Esbaugh and Tufts 2006). La CAII sembra essere in uno stato ancestrale nei pesci, mostrando alta attività, fino ai teleostei dove apparentemente si è duplicata in due diverse isoforme, la CAb (eritrocitaria) e la CAc (citoplasmatica) (Esbaugh et al., 2004; Esbaugh et al., 2005). Il lavoro svolto durante il mio dottorato può essere suddiviso in tre parti principali: 1. Il clonaggio e il sequenziamento di GPX di pesci antartici per individuare mutazioni aminoacidiche nella sequenza della proteina caratteristiche di queste specie e fare una ricostruzione filogenetica dell’enzima. Anche in questo caso si è partiti con un’estrazione di RNA da branchie. La ricostruzione filogenetica ci ha permesso di indagare la storia evolutiva di tali proteine confrontandole con sequenze di GPX di altri teleostei e di altri vertebrati e prendendo in considerazione la storia evolutiva degli organismi. I pesci sono stati campionati durante la XIV (1998-1999), la XVII (2001-2002) e la XXI (2005-2006) campagna italiana in Antartide. 2. Il clonaggio e il sequenziamento di CA di pesci antartici e di zone intertidali (mangrovieti e acque ipersaline). Questo è stato ottenuto partendo dall’estrazione di RNA da tessuto branchiale o intestinale di tali pesci. Ottenute le sequenze delle CA, queste sono state utilizzate per un’analisi filogenetica. Le sequenze sono state confrontate tra loro e con le sequenze di CA disponibili in rete per evidenziare la presenza di zone conservate o meno ed è stata fatta una ricostruzione tridimensionale per vedere e confrontare la distribuzione di potenziale elettrico delle stesse. La ricostruzione filogenetica è servita per delineare un’ipotetica evoluzione di tali enzimi in confronto con gli enzimi di altri teleostei e di altri vertebrati tenendo conto della storia evolutiva di tali organismi. (I pesci sono stati campionati durante la XIV (1998-1999), la XVII (2001-2002)e la XXI (2005-2006) campagna italiana in Antartide.) 3. Il clonaggio e il sequenziamento della CA del Gulf Toadfish (Opsanus beta), un teleosteo che vive in zona intertidale con tendenza all’ipersalinità. Una volta ottenuta la sequenza (partendo anche in questo caso da estrazione di RNA da tessuti) è stata fatta una ricostruzione filogenetica e delle analisi di attività ed espressione dell’enzima. I tessuti analizzati sono intestino (anteriore, medio e posteriore), retto e branchie. L’analisi è stata fatta su campioni controllo (stabulati alla stessa salinità dell’acqua in cui vivono (40ppt) e su pesci stabulati in condizioni d’ipersalinità (60ppt) per 6-12-24-48-96 ore (per quanto riguarda le misure di espressione nei vari segmenti di intestino e retto) o due settimane (per quanto riguarda misure di espressione e attività su branchie e di attività sui segmenti di intestino e retto). Questo studio è stato svolto per indagare il coinvolgimento della CA a livello intestinale e branchiale nell’osmoregolazione di pesci d’acqua salata se sottoposti a un ambiente ipersalino. Per questa parte del lavoro mi sono recata da aprile a ottobre 2009 presso il laboratorio del professor Martin Grosell (RSMAS, University of Miami, Florida, USA). Risultati e Discussione Glutatione Perossidasi La sequenza della GPX1 selenio-dipendente è stata ottenuta per i pesci antartici Trematomus bernacchii (946 bp), T. lepidorhinus (946 bp), T. eulepidotus (945 bp) e Cygnodraco mawsoni (950 bp). Tutte le sequenze sono caratterizzate da un open reading frame (ORF) di 191 amminoacidi. In posizione nucleotidica 174-176 è presente la tripletta TGA che codifica per la selenocisteina, un amminoacido facente parte della triade catalitica. La proteina sequenziata corrisponde all’isoforma 1 (citoplasmatica) perché dalla ricostruzione filogenetica ottenuta con il metodo del NJ le sequenze si pongono tutte in un cluster vicino all’isoforma 1 e separato dal gruppo dalle GPX2. Si può ipotizzare un’origine monofiletica all’interno dei teleostei antartici, che sono un clade completamente separato. Questo enzima sembra essersi evoluto nei pesci antartici indipendentemente dalle altre specie di teleostei. La ricostruzione filogenetica ottenuta conferma le odierne analisi filogenetiche sull’evoluzione delle GPX (Margis et al., 2008; Toppo et al., 2008). Le varie isoforme risultano separate da valori di bootstrap che si approssimano al 100%, dimostrando che le isoforme 1, 2 e 3 sono più vicine filogeneticamente fra loro, mentre le isoforme 7 e 8 sono più affini alla GPX4. Il cluster dei teleostei antartici risulta indipendente e ben separato dagli altri con valori di bootstrap del 100%, avvalorando l’idea di un’origine monofiletica della proteina in questo gruppo. All’interno del ramo dei teleostei antartici, le distanze evolutive appaiono molto brevi, indicando che la diversificazione della GPX nelle diverse specie è avvenuta in tempi piuttosto recenti. In questo gruppo le relazioni evolutive non sono completamente risolte, nonostante alcuni nodi siano sostenuti da alti valori di bootstrap. La GPX di C. mawsoni risulta essere il sister group delle GPX delle specie appartenenti al genere Trematomus. Analisi filogenetiche basate sullo studio delle subunità 16S e 12S dell’rRNA mitocondriale, indicano Cygnodraco mawsoni come sister group della famiglia dei Nototheniidae, alla quale appartiene anche il genere Trematomus (Bargelloni et al. 2000), confermando la ricostruzione filogenetica. Il lavoro di (Epp et al. 1983) ha determinato per la prima volta la struttura cristallografica della GPX1 bovina e ha evidenziato la triade catalitica rappresentata da selenocisteina (40), glutammina (75) e triptofano (153). E’ stato proposto che nel sito attivo la glutammina e il triptofano siano legati mediante ponti idrogeno alla selenocisteina e che attivino l’elemento redox (il selenolo) proprio grazie a questo legame che dovrebbe facilitare l’attacco nucleofilico dell’idroperossido. Questi aminoacidi sono, infatti, altamente conservati anche nei teleostei. I residui coinvolti nella formazione dei foglietti β e delle α-eliche rimangono, tranne alcune eccezioni, invariati. La regione che sembra avere un ruolo fondamentale nella capacità di dimerizzazione della proteina è rappresentata dai residui 89-95, che mancano nella GPX4, che per questo motivo presenta una struttura monomerica (Scheerer et al. 2007). Questi residui sono conservati anche nei teleostei, anche se con alcune eccezioni. La Val90 è stata sostituita nei soli teleostei antartici, da un altro amminoacido alifatico, la leucina. Mentre negli anfibi e nei mammiferi in posizione 94 è presente una glicina, nei teleostei troviamo quattro amminoacidi diversi, tutti residui polari: nei teleostei antartici troviamo una lisina (carica positiva), in H. molitrix un aspartato (carica negativa), in D. rerio un glutammato (carica negativa) e negli altri teleostei una asparagina (senza carica). Possiamo ipotizzare che tali cambiamenti aminoacidici abbiano un effetto sulla velocità e sull’efficienza della reazione catalizzata dalla GPX. Carbonico anidrasi La carbonico anidrasi di tre specie antartiche e di due specie di zona intertidale è stata sequenziata completamente (Trematomus bernacchii (1062 bp), T. lepidorinhus (1656 bp), T. eulepidotus (1563 bp) per le specie antartiche e Periophtalmus sobrinus (1217 bp) e Opsanus beta (1827 bp) per le specie intertidali). Una quarta sequenza, mancante di una parte in 3’, è stata ottenuta per Cygnodraco mawsoni (713 bp), (specie Antartica) tutte con un ORF di 260 aminoacidi (GenBank accession number: GQ443602 (T. bernacchii); GQ443601 (T. lepidorinhus); GQ443600 (T. eulepidotus); GQ443603 (Periophtalmus sobrinus). Queste sequenze saranno disponibili a partire da settembre 2010 mentre per Opsanus beta (GQ443599) la sequenza è già disponibile in rete) Le sequenze mostrano un’identità piuttosto alta con le sequenze di CAII disponibili in database (dall’80% al 72%). Per questo e perché nell’albero ottenuto con il Neighbor Joining (NJ) raggruppano nel cluster delle CAII, possiamo ritenere che si tratti dell’isoforma II. Nell’albero ottenuto sono ben visibili le separazioni tra il gruppo delle CA di membrana e quelle citoplasmatiche. Tra quest’ultime vi è un’altra separazione, tra le CAII citoplasmatiche (CAIIc) e le CAII citoplasmatiche eritrocitarie (CAIIb). Possiamo ipotizzare che la CA di Opsanus beta sia l’isoforma CAIIc, ovvero che si tratti dell’isoforma citoplasmatica e non di quella eritrocitaria (CAIIb), perché nella ricostruzione filogenetica è raggruppata insieme alla CAc di trota. La CA del mudskipper, invece, raggruppa con le isoforme CAb di trota, carpa e zebrafish. Un’altra divisione ben delineata e mostrata anche nell’albero ottenuto da Esbaugh et al., 2006, è quella esistente tra mammiferi e non mammiferi. Le CA di pesci antartici raggruppano insieme in un cluster separato dagli altri e ben supportato da alti valori di bootstrap, sottolineandone la stretta relazione filogenetica. Anche l’icefish (Chionodraco hamatus) raggruppa in questo cluster. Gli aminoacidi che compongo la triade catalitica (His 94, 96, 119) e quelli che mantengono la struttura funzionale della proteina (Thr 199 e Glu 106) sono conservati, mentre possiamo notare dei cambiamenti a livello aminoacidico propri delle sequenze di carbonico anidrasi dei pesci Antartici. In posizione 10-11 si trovano una Ala e una Asn conservate solo nelle sequenze di CA di pesci antartici, come in posizione 157 dove vi è una Ser e in posizione 190-191 con una Gly e una Cys. Carbonico anidrasi in Opsanus beta La carbonico anidrasi sequenziata (GenBank accession number GQ443599) è di 1827 paia di basi con un ORF di 260 aminoacidi. La sequenza mostra un’identità del 78% con Oncorhynchus mykiss e Pseudopleuronectes americanus, del 77-76% con le altre sequenze di CA di teleostei, e del 63-59% con anfibi e mammiferi. Le analisi filogenetiche effettuate con il metodo del NJ raggruppano la CA con le isoforme citoplasmatiche degli altri teleostei e la separano dalle isoforme di membrana (CA IV, IX, XII, XIV, XV) e dalle sequenze di mammiferi e di altri tetrapodi, in accordo con quanto riportato da altri studi. La CAII può essere suddivisa in due isoforme, la CAIIc (citoplasmatica) e la CAIIb (citoplasmatica eritrocitaria). La ricostruzione filogenetica ottenuta suggerisce che l’isoforma sequenziata sia di tipo CAIIc poiché raggruppa con le CAIIc di altri pesci. Su branchie, intestino (anteriore, medio e posteriore) e retto sono state condotte misure di espressione dell’mRNA tramite qPCR. Intestino e retto mostrano simile espressione in pesci acclimatati all’acqua salata mentre le branchie mostrano un’espressione più elevata. Nei pesci sottoposti a ipersalinità (60 ppt), si osservano alti livelli di espressione rispetto al controllo (40 ppt) nell’intestino medio e posteriore e nel retto. In particolare l’intestino medio risponde per ultimo all’ipersalinità, dopo 96 ore di esposizione, mentre il retto mostra una maggiore attività già dopo 12 ore di esposizione mantenendosi stabile per tutto il tempo. L’intestino posteriore mostra un rapido incremento di espressione dopo 6 ore di esposizione con un decremento dopo 12 e 24 ore seguito da un altro incremento dopo 96 ore. Per quanto riguarda le branchie, è stato possibile fare misure di espressione su branchie perfuse solo dopo due settimane di stabulazione all’ipersalinità. I dati ottenuti non mostrano un incremento nell’espressione in pesci a 40 ppt o a 60 ppt. L’attività, misurata su tessuti di pesci controllo (40 ppt) e su tessuti di pesci esposti per due settimane a 60 ppt mostra un significativo incremento nella frazione citosolica nei tessuti dopo l’esposizione. L’attività totale, confrontata con la citosolica, mostra un minor incremento. Diversi studi mostrano che la CA è coinvolta nell’osmoregolazione in teleostei marini. Usando inibitori (Grosell and Genz 2006), è stato dimostrato che la CA ha un ruolo chiave per la secrezione intestinale di HCO3- in teleostei marini. In questo studio è stato dimostrato il coinvolgimento di questo enzima in tessuti intestinali e branchie in risposta all’ipersalinità. Il confronto tra l’espressione e l’attività registrata rivela una diversa risposta. L’espressione di mRNA incrementa nell’intestino posteriore e nel retto con effetto non evidente a livello branchiale, intestino anteriore e medio. Invece, l’attività dell’enzima aumenta visibilmente in tutti i tessuti. Le nostre osservazioni rivelano, quindi, una maggiore espressione nei tessuti distali dell’intestino. Invece, la parte anteriore dell’intestino che sotto normali condizioni di salinità è responsabile della maggior parte dell’escrezione di HCO3- non mostra un visibile cambiamento di espressione nei tessuti di pesci acclimatati a ipersalinità. Questo è in contrasto con quanto trovato nella trota (Grosell et al. 2007), dove l’attività era maggiore nella regione anteriore dell’intestino piuttosto che nella posteriore. Nelle branchie, l’attività della CA è confrontabile con quella registrata nelle diverse regioni dell’intestino. Le nostre osservazioni possono suggerire un coinvolgimento della CA branchiale nell’osmoregolazione ad ambienti ipersalini. L’incremento della capacità della CA branchiale di idratare la CO2 in pesci sottoposti a ambienti ipersalini, può aumentare la disponibilità di HCO3- e protoni e quindi conferire una maggiore abilità di trattenere HCO3- trasportata attraverso la membrana basolaterale e/o la secrezione di protoni attraverso la membrana apicale.