Circadian Clock Study Through Frequency-Encoded Entrainment Stimulations

Circadian clocks are intrinsic, time-tracking systems that enable organisms to maintain their physiological state and their synchrony with the 24-hour rotation of the Earth, by partitioning behavioural and metabolic processes according to time of day within each tissue. They are entrained to the external environment by light/dark cycles and by food timing, which act as clock synchronizers. Emerging evidence suggests that circadian regulation is intimately linked to metabolic homeostasis and that dysregulation of circadian rhythms can contribute to disease. Conversely, metabolic signals also feed back into the circadian system, modulating circadian gene expression and behaviour. Conventional experimental approach of circadian clock in vitro studies is based on single-pulse stimulation of only one metabolite or hormone, while in vivo peripheral tissues are exposed to periodic oscillating stimuli of a large number of metabolites and hormones, whose variations are in most cases interconnected, as for example glucose and insulin. Moreover, only one or few clock genes are generally considered, while it is known that a large number of genes, thus biological processes, are under circadian regulation. Therefore, this Ph.D. research work is aimed at the development of technologies and data analysis tools to investigate the entrainment of peripheral mammalian circadian clock to frequency-encoded metabolic stimuli, which well mimic physiological oscillations at which peripheral tissues are exposed in vivo. Technologies, and, more specifically, microtechnologies have been developed to investigate the effects of periodic metabolic entrainment, showing that in murine fibroblasts oscillatory periodic metabolic stimulations entrain the expression of Per2, one of the core genes of the circadian molecular mechanism. Moreover, it has been proven that only by metabolic oscillations it is possible to completely reset the phase of cell-autonomous clocks. In order to develop a physiological and pathological in vitro model, achieving a high spatio-temporal control of cell culture microenvironment, frequency-encoded perturbations have been automated in a newly designed microfluidic platform for circadian applications. Finally, to broaden the description of genes expressed with a circadian temporal pattern, a new data analysis method has been proposed and characterized, that allows to identify circadian genes in whole transcriptome data, to group genes based on the phase of their expression, to visualize transcriptome data at a glance and clearly identifying modifications at the transcriptome level from one biological condition to another one.

I ritmi circadiani sono meccanismi biologici di organizzazione temporale intrinseci e autosostenuti, che consentono agli organismi di anticipare i cambiamenti ambientali e permettono loro di adattare il loro comportamento e la loro fisiologia nell’arco della giornata. L’orologio circadiano è sincronizzato dai cicli luce/buio e dall’ora dei pasti. La funzione biologica essenziale del ritmo circadiano è mantenere lo stato fisiologico dell’organismo e la sua sincronia comportamentale e metabolica con l’ambiente esterno. Recentemente è stato dimostrato che l’orologio circadiano garantisce il mantenimento dell’omeostasi metabolica, e che una distruzione del ritmo circadiano è causa di numerose malattie. L’approccio sperimentale convenzionale per lo studio dell’orologio circadiano in vitro è basato su una singola stimolazione di un solo metabolita o ormone, mentre in vivo i tessuti sono esposti in continuo a stimoli oscillatori periodici di una grande vastità di metaboliti e ormoni, le cui variazioni sono spesso interconnesse, come nel caso di glucosio e insulina. Inoltre, nell’analisi sperimentale convenzionale, sono studiati solo uno o pochi geni noti per essere implicati nell’orologio circadiano, mentre è noto che un elevato numero di geni sono espressi in modo circadiano. Lo scopo di questo progetto di ricerca è quindi sviluppare tecnologie e metodi di analisi per studiare l’effetto di stimoli metabolici in frequenza sull’orologio circadiano di tessuti periferici. Questi stimoli riproducono infatti in vitro le oscillazioni metaboliche a cui i tessuti sono esposti in vivo. Tecnologie, e più nello specifico, microtecnologie sono state sviluppate per studiare gli effetti di stimoli metabolici oscillatori, ed è stato dimostrato che in fibroblasti murini l’espressione di Per2 (uno dei geni principali del meccanismo molecolare dell’orologio circadiano) è sincronizzata da stimoli metabolici oscillatori. Inoltre, è stato dimostrato che le oscillazioni metaboliche sono di per sé sufficienti per allineare l’orologio circadiano nei tessuti periferici. Per sviluppare un modello che riproducesse in vitro condizioni sia fisiologiche che patologiche, raggiungendo un controllo spazio-temporale preciso del microambiente cellulare, le stimolazioni in frequenza sono state automatizzate in un dispositivo microfluidico progettato in modo dedicato per studi del ritmo circadiano. Infine, per estendere lo studio ai geni espressi con un pattern temporale circadiano, un nuovo metodo di analisi è stato proposto e caratterizzato. Il metodo permette di identificare geni circadiani da dati di trascrittomica, di suddividere i geni basandosi sulla fase della loro espressione, di visualizzare dati di trascrittomica nel loro complesso e di individuare rapidamente e in modo semplice modifiche a livello trascrizionale da una condizione biologica ad un’altra.