Identification of Annexin 2A as a fundamental mediator of glioblastoma cell dissemination and potential therapeutic target

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most devastating tumor of the brain, characterized by an almost inevitable tendency to recur after intensive treatments and a fatal prognosis. Indeed, despite recent technical improvements in GBM surgery, the complete eradication of cancer cell disseminated outside the tumor mass still remains a crucial issue for glioma patients management. In my PhD project, we identified Annexin 2A (ANXA2) as an important intracellular cytoskeletal protein expressed also on the surface of various types of cancer cells. Initially, we show that ANXA2 is over-expressed in IV grade GBM at various levels when compared to lower stage tumors. More importantly, we demonstrated that low/absent expression of ANXA2 identifies a subgroup of GBM patients endowed with better prognosis, suggesting that ANXA2 expression can be considered as an independent prognostic factor in glioma. We then analyzed the transcriptional changes associated to different levels of ANXA2 expression. In particular, we generated a series of ANXA2 dependent transcriptional signatures based on the comparison between ANXA2hi versus ANXA2lo expressing GBM patients from the TCGA and GSE13041 datasets (719 differentially expressed genes in common between the two cohorts), modulated transcripts after ANXA2 neutralization by specific antibody (855 differentially expressed genes) and the expression profiles of ANXA2 silenced cells respect to relative controls (3592 differentially expressed genes) in our primary GBM cell cultures. Interestingly, Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) on the three different signatures obtained, revealed a negative enrichment of cell migration and mesenchymal transition related genes. These data strongly suggested the important role played by ANXA2 in GBM cell behavior and aggressiveness, allowing us to further setup strategies to specifically modulate its functions and dependent intracellular signaling. For this reason, we further analyzed ANXA2 functional activity in vitro in primary GBM cell cultures, demonstrating as ANXA2 is a major sustainer of GBM cell aggressiveness by regulating cellular invasion and motility together with cancer cell proliferation and differentiation status. Moreover, based on gene expression data of ANXA2 neutralized cells, we were able to test the prognostic potential of an ANXA2down signature in multiple cancer datasets, demonstrating that expression of genes regulated by ANXA2 fluctuations predict cancer patients outcome by themselves. Finally, we then functionally mapped an ANXA2-dependent gene signature (TCGA and GSE13041 datasets analysis) by exploiting the Connectivity Map bioinformatic tool in order to identify compounds and approved drugs able to revert this signature of GBM aggressiveness. The compounds, significantly predicted to be able to counteract the ANXA2-dependent transcriptional signature, were analyzed for their ability to inhibit GBM cell invasion in vitro in primary GBM cultures. Finally, we applied ANXA2 dependent transcriptional signatures, previously generated from our primary GBM cells, to the QUADrATiC tool, which was allowed the exploration of a larger database of reference cell lines and perturbagens.

Il Glioblastoma Multiforme (GBM) è il tumore cerebrale più aggressivo, caratterizzato da una prognosi infausta e dall’inevitabile tendenza a ricadere anche in seguito ad un trattamento intensivo. Nonostante i recenti miglioramenti tecnici nella chirurgia del GBM, la sua completa rimozione rimane ad oggi uno dei maggiori problemi legati all’insuccesso terapeutico di questi pazienti. Questo studio si focalizza sulla caratterizzazione di annessina 2A (ANXA2), proteina presente in diversi compartimenti delle cellule normali e ritrovata anche sulla superficie di diversi tipi di cellule tumorali. Con lo sviluppo di questo progetto, abbiamo dimostrato che ANXA2 è espressa ad alti livelli nei gliomi di IV grado rispetto ai gliomi di grado minore e che una bassa/nulla espressione di ANXA2 identifica un sottogruppo di pazienti caratterizzati da una prognosi migliore, suggerendo come l’espressione di ANXA2 possa essere considerata un fattore prognostico indipendente nei gliomi. Successivamente, con lo scopo di analizzare i cambiamenti trascrizionali associati ai differenti livelli di espressione di ANXA2, abbiamo generato una signature trascrizionale ANXA2-dipendente utilizzando i dati provenienti dai dataset pubblici TCGA e GSE13041 e basata sul confronto tra pazienti esprimenti alti livelli di ANXA2 e pazienti esprimenti bassi livelli di questa proteina (719 geni differenzialmente espressi in comune tra le due coorti). Sono state quindi generate due signature ANXA2-dipendenti basate rispettivamente sui trascritti modulati in seguito alla neutralizzazione di ANXA2 con anticorpo specifico (855 geni differenzialmente espressi) e tramite silenziamento (3592 geni differenzialmente espressi), in colture primarie di GBM. L’analisi di gene set enrichment (GSEA) condotta sulle tre signature, ha rivelato un arricchimento negativo di geni legati ai processi di migrazione cellulare e transizione epitelio-mesenchimale. Questi dati hanno fortemente suggerito l’importante ruolo svolto da ANXA2 nel comportamento e nell’aggressività delle cellule di GBM, portandoci pertanto a programmare differenti strategie per modulare le sue funzioni e le vie di segnale intracellulare ad essa correlate. Per questo motivo, è stata condotta una serie di analisi funzionali in vitro in cellule primarie di GBM, dimostrando come ANXA2 sia un principale mediatore dell’aggressività di questo tumore attraverso la regolazione di processi quali motilità cellulare, proliferazione e differenziamento. Inoltre, basandoci sul profilo d’espressione genica di cellule di GBM in cui abbiamo inibito la funzione di ANXA2, abbiamo validato il potenziale prognostico di una signature “ANXA2down” (basata sui geni maggiormente down-regolati in cellule di GBM trattate con anticorpo neutralizzante ANXA2) in diversi dataset pubblici, dimostrando come l’espressione di geni regolati dai livelli di ANXA2 sia in grado di predire l’andamento dei pazienti. Infine, la signature precedentemente generata dai dataset TCGA e GSE13041 è stata mappata funzionalmente utilizzando il tool bioinformatico Connectivity Map con lo scopo di identificare composti in grado di revertire tale signature. I composti identificati sono stati analizzati successivamente per la loro abilità di inibire il processo di invasione in vitro in colture primarie di GBM. Inoltre, le signature ANXA2-dipendenti, ottenute dalle precedenti analisi (cellule inibite/silenziate per ANXA2), sono state applicate al tool QUADrATiC. Ciò ha permesso di approfondire i risultati grazie all’utilizzo di un database più ampio che si basa sullo studio di un numero maggiore di composti approvati in numerose linee cellulari.