Advancements in Molecular Prognostics and Diagnostics of Pediatric Myelodysplastic Syndrome and Juvenile Myelomonocytic Leukemia

Myelodysplastic syndromes (MDS) and juvenile myelomonocytic leukemia (JMML) are rare hematopoietic stem cell diseases constituting less then 5% of hematopoietic neoplasia in childhood. Pediatric MDS is an heterogeneous groups of disorders with ineffective hematopoiesis and a varying propensity to evolve into acute myeloid leukemia (AML). Juvenile myelomonocytic leukemia (JMML) is a very aggressive myeloproliferative/ myelodysplastic disease characterized by excessive proliferation of granulocytic and monocytic cells and classified by the World Health Organization (WHO) as a separate entity between myeloproliferative neoplasms (MPN) and MDS. The diagnosis of JMML and MDS is difficult and based mainly on morphological criteria, although the revised WHO classification and the proposal of minimal diagnostic criteria have largely improved the diagnosis of these uncommon but appalling childhood diseases. The International Prognostic Scoring System for MDS, which is based on BM blast percentage, cytopenia and cytogenetics, showed limited value for the diagnosis of both MDS and JMML reflecting the differences between MDS and myeloproliferatives disease in children and adults. New molecular markers are being sought to make the diagnosis and the prognosis of these disorders more efficient and rapid. In this study we applied the most recent high throughput technologies (e.g. gene expression analysis, multiparametric phospho-flow cytometry and next generation sequencing) not only to provide new diagnostic and prognostic tools that can be used together with the well-established gold standard techniques but also to reveal new molecular pathways deregulated in these diseases. Using gene expression based classification we identified two different signatures in both MDS and JMML with clinical relevance. In MDS patients we identified a group with high risk of evolution into AML; similarly, in JMML patients the classification identified JMML with distinct prognosis outperforming all known clinical parameters in terms of prognostic relevance. Moreover, gene expression profiling in MDS patients provided new target genes involved in the leukemic process toward AML evolution. Aiming to provide a diagnostic tool for the rapid diagnosis of JMML, we used phospho-flow cytometry and created a simple algorithm for the diagnosis of JMML based on the percentage of p-STAT5 positive cells. Then, we assessed the feasibility and robustness of ultra deep sequencing technology to detect the mutation load in hematological malignancies. Finally, we report the case of two twins with concordant JMML providing new insight into the pathogenesis of the disease. In conclusion, all these data clearly showed that the application of gene expression profile analysis, next generation sequencing and phospho-flow cytometry for studying MDS and JMML provided new important tools for the prognosis and the diagnosis of these rare but aggressive diseases.

Le sindromi mielodisplastiche (MDS) e la leucemia mielomonocitica giovanile (JMML) sono dei rari disordini ematologici derivanti da disfunzioni a carico delle cellule staminali ematopoietiche e costituiscono meno del 5% di tutte le malattie neoplastiche ematologiche in età pediatrica. Le MDS sono un gruppo eterogeneo di malattie caratterizzate principalmente da un’ alterata maturazione delle cellule ematopoietiche della filiera mieloide e il maggiore fattore di rischio che le contraddistingue è l’evoluzione in leucemia mieloide acuta (LAM). La leucemia mielomonocitica giovanile è una malattia molto aggressiva, caratterizzata da un’ eccessiva proliferazione di cellule granulocitiche e monocitiche e viene classificata dall’ Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) come una entità separata con caratteristiche intermedie tra le neoplasie mieloproliferative e le sindromi mielodisplastiche. La diagnosi di MDS e JMML, basata principalmente su caratteristiche morfologiche, è molto difficile; tuttavia i nuovi criteri diagnostici recentemente introdotti nella classificazione OMS ne hanno facilitato la diagnosi. Attualmente la prognosi sull’ IPSS (International Prognostic Scoring System) dell’ adulto, un sistema di assegnazione dei pazienti a diverse fasce di rischio basato sulla percentuale di blasti nel midollo osseo, presenza o meno di citopenia e dati di citogenetica, mostra delle limitazioni quando applicato alle MDS e JMML pediatriche, riconducibile alle differenze esistenti tra le malattie mieloproliferative dell’adulto e del bambino. Nuovi markers biologici sono, perciò, necessari per migliorare non solo la diagnosi ma anche la prognosi di queste malattie. In questo studio abbiamo impiegato le più recenti tecnologie (i.e. l’analisi dell’ espressione genica, il sequenziamento di ultima generazione e la citofluorimetria per l’ identificazione dello stato di fosforilazione) non solo per fornire dei nuovi strumenti per la diagnosi e la prognosi da affiancare alle tecniche gold-standard ma anche per individuare nuovi processi biologici alterati in queste malattie. Mediante lo studio dell’espressione genica, abbiamo identificato la presenza di due sottogruppi con un diverso andamento clinico sia nelle MDS che nelle JMML. Abbiamo individuato i pazienti MDS con un più alto rischio di evoluzione in LAM e classificato i pazienti JMML in due gruppi con diversa prognosi; l’analisi dell’espressione genica nelle JMML è risultata essere uno strumento in grado di superare per valore prognostico tutti i criteri clinici attualmente impiegati. Inoltre, l’analisi del profilo d’ espressione genica nelle MDS ha permesso di individuare nuovi geni target coinvolti nella progressione verso la LAM. Al fine di fornire, poi, un nuovo strumento per la diagnosi di JMML abbiamo sviluppato un semplice algoritmo per la diagnosi di JMML basato sulla percentuale di cellule positive per STAT5 fosforilato in citofluorimetria. Abbiamo valutato, poi, la possibilità di applicare la tecnologia del sequenziamento di ultima generazione (ultra deep sequencing) per l’ identificazione della quantità di mutazioni presente nel midollo delle JMML. Infine, abbiamo riportato i dati relativi all’analisi di due gemelli concordanti con diagnosi di JMML al fine di fornire nuovi dati per la comprensione della patogenesi di questa malattia. In conclusione, abbiamo potuto dimostrare come l’impiego dello studio dell’espressione genica, del sequenziamento di ultima generazione e della citofluorimetria per l’identificazione di STAT5 fosforilato siano nuovi e validi strumenti per la prognosi e la diagnosi di queste rare malattie pediatriche.