Extracellular matrix-degrading enzymes and control of fibroblast growth factor-2 (FGF-2) signaling in pediatric glioma cell lines

The main purpose of my research project was to investigate the role of two extracellular matrix-degrading enzymes, heparanase (HPSE) and membrane-type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP), in pediatric gliomas. I spent the first two years of my PhD program in Dott. Maurizio Onisto’s laboratory (University of Padua). Then I continued my work at New York University School of Medicine, under the supervision of Prof. Paolo Mignatti, whose experimental work focuses on the molecular mechanisms of proteolysis-independent signaling by MT1-MMP and its physiological inhibitor, tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2). Gliomas, the most common primary brain tumors, comprise a heterogeneous group of neoplasms that originate from glial cells. Despite recent advances in the management of these tumors, children affected by gliomas, particularly the more aggressive forms, have a poor prognosis. Gliomas can diffusely penetrate throughout the brain, even though they remain localized in this organ. One of the most important events during glioma cell invasion is extracellular matrix (ECM) degradation, a complex mechanism that involves both glycosidic and proteolytic enzymes. HPSE is an endo-β-D-glucuronidase secreted in the ECM, where it cleaves the heparan sulfate side chains of both soluble and membrane-bound proteoglycans. MT1-MMP, a cell membrane-bound proteinase with an extracellular catalytic domain and a short cytoplasmic tail, has been implicated in the proteolytic degradation of extracellular and transmembrane proteins. High levels of HPSE and MT1-MMP are present in a variety of aggressive malignancies, a finding that highlights their important role in cancer invasion and metastasis. In this study we characterized pediatric glioma cell lines derived from different types of gliomas: two glioblastoma multiforme, one anaplastic astrocytoma, one diffuse astrocytoma and one pilocytic astrocytoma. In addition, we used a human breast adenocarcinoma cell line to examine the role of MT1-MMP, because these cells do not express this proteinase and thus represent an ideal model for the regulation of its expression. The data reported here show that MT1-MMP controls activation of intracellular signaling by fibroblast growth factor-2 (FGF-2) and FGF-2 binding to the breast adenocarcinoma cells. We found no clear correlation between HPSE, MT1-MMP or FGF-2 expression and the aggressiveness of the pediatric astrocytoma cells. Gene silencing of HPSE in a pediatric glioblastoma cell line does not affect vascular endothelial growth factor (VEGF) expression or cell proliferation, but upregulates matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and MT1-MMP expression. Moreover, ERK1/2 activation by FGF-2 does not correlate with MT1-MMP expression and is modified by an MMP inhibitor in these pediatric glioma cells. Finally, TIMP-2 controls ERK1/2 activation in all glioma cells. Taken together, the results show that MT1-MMP does not have the same effects in breast carcinoma and pediatric glioma cells, indicating a different and more complex control mechanism of intracellular signaling. This initial characterization of these unique pediatric astrocytoma cell lines provides new insights into the knowledge of this poorly studied group of tumors.

L’obiettivo principale del mio progetto di ricerca è stato analizzare il ruolo di due enzimi che degradano la matrice extracellulare, l’“heparanase” (HPSE) e la “membrane-type 1 matrix metalloproteinase” (MT1-MMP), nei gliomi pediatrici. Ho trascorso i primi due anni di Dottorato nel laboratorio del Dott. Maurizio Onisto (Università di Padova). Ho poi continuato il mio lavoro presso la New York University School of Medicine, sotto la supervisione del Prof. Paolo Mignatti, il cui lavoro sperimentale è focalizzato sull’approfondimento dei meccanismi molecolari alla base dell’attivazione del segnale intracellulare da parte di MT1-MMP e del suo inibitore fisiologico, il “tissue inhibitor of metalloproteinases-2” (TIMP-2). I gliomi, i più comuni tumori cerebrali primari, comprendono un gruppo eterogeneo di neoplasie che originano dalle cellule gliali. Nonostante i recenti progressi raggiunti nel trattamento e nel controllo di tali tumori, la prognosi dei bambini affetti da glioma, ed in particolare dalle sue forme più aggressive, rimane tuttora infausta. Pur essendo confinati nell’organo nel quale originano, i gliomi possono invadere tutte le aree del cervello. Uno degli eventi più importanti che caratterizzano l’invasività dei gliomi è costituito dalla degradazione della matrice extracellulare, un complesso meccanismo che coinvolge enzimi sia glicosidici sia proteolitici. HPSE è una endo-β-D-glucuronidasi secreta nella matrice extracellulare, nella quale taglia le catene di eparan solfato dei proteoglicani solubili e legati alla membrana. MT1-MMP, una proteasi legata alla membrana e composta da un dominio catalitico extracellulare e da una piccola coda citoplasmatica, è coinvolta nella degradazione proteolitica di proteine extracellulari e di membrana. Elevati livelli di HPSE e MT1-MMP sono stati riscontrati in numerosi tipi di tumore e tale evidenza sottolinea il ruolo chiave che essi svolgono nell’invasività tumorale e nella formazione di metastasi. In questo studio sono state caratterizzate cinque linee cellulari di glioma pediatrico derivanti da diversi tipi di glioma: due glioblastomi multiformi, un astrocitoma anaplastico, un astrocitoma diffuso ed un astrocitoma pilocitico. Con lo scopo iniziale di esaminare il ruolo di MT1-MMP nell’attivazione del segnale indotto dall’FGF-2, è stata inoltre utilizzata una linea cellulare di carcinoma mammario, la quale non esprime MT1-MMP e perciò rappresenta un modello ideale per studiare la regolazione della sua espressione. I dati riportati mostrano che, nelle cellule di carcinoma mammario, MT1-MMP regola l’attivazione del segnale intracellulare da parte del “fibroblast growth factor-2” (FGF-2) e controlla il legame di questo fattore di crescita alla superficie delle cellule. Nelle cellule di astrocitoma pediatrico non è stata identificata alcuna chiara correlazione tra espressione di HPSE, MT1-MMP o FGF-2 ed aggressività tumorale. I risultati inoltre dimostrano che il silenziamento genico di HPSE in una linea cellulare di glioblastoma pediatrico non influenza l’espressione del “vascular endothelial growth factor” (VEGF) o la proliferazione cellulare, ma determina la sovraespressione della “matrix metalloproteinase-2” (MMP-2) e di MT1-MMP. Inoltre, nelle cellule di glioma, l’attivazione di ERK1/2 da parte di FGF-2 non correla con l’espressione di MT1-MMP e risulta modificata dal trattamento con un inibitore di MMP. Infine, in tutte le cellule di glioma, anche TIMP-2 regola l’attivazione del segnale intracellulare. In conclusione, i risultati ottenuti mostrano che MT1-MMP non ha gli effetti nelle cellule di carcinoma mammario e di glioma pediatrico, indicando l’esistenza di un differente e più complesso meccanismo di controllo del segnale intracellulare. La caratterizzazione delle linee cellulari di astrocitoma pediatrico presentata in questa tesi offre una più completa conoscenza di questo gruppo di tumori ancora poco studiati.