Notch3 signalling promotes tumour growth in colorectal cancer: implication for Notch target therapy

It is well known that aberrant activation of the Notch pathway plays a critical role in the pathogenesis of T cell acute lymphoblastic leukaemia (T-ALL) and of certain solid tumors including lung, breast and ovarian cancer. In particular, increased Notch1 activity has been observed in intestinal adenoma, partially accomplished by β-catenin-mediated up-regulation of the Notch ligand Jagged-1. Whether further mechanisms of Notch activation exist and other Notch receptors might be involved in colorectal cancer (CRC) has not been investigated so far. In this study we investigated the possible involvement of Notch3 signaling in CRC, and the possible therapeutic implications. Intrigued by the observation that Notch3 mRNA and protein are over-expressed in a subset (20%) of human CRC, we sought to investigate how Notch3 modulates oncogenic features of CRC cells. By exploiting xenografts of CRC cells with different tumorigenic properties in mice, we found that the aggressive phenotype was associated with altered expression of components of the Notch pathway, including augmented expression of Delta-like 4 (DLL4) and Jagged-1 ligands and increased levels of the Notch3 transcript and intracellular domain (ICD). Stimulation with immobilized recombinant DLL4 dramatically increased Notch3 expression and Notch signaling. Moreover, forced expression of an active form of Notch3 mirrored effects of DLL4 stimulation and increased tumor formation. Conversely, blocking Notch3 signaling resulted in perturbation of the cell cycle followed by reduction of cell proliferation and inhibition of tumor growth. Moreover, we observed that these CRC cells have also different metastatic potential in terms of number and dimension when injected intravenously in mice. Lung metastases formed by CRC cells expressed Notch3, but the number or size was not significantly reduced by anti-Notch2/3 treatment. Overall, these findings indicate that Notch3 receptor can modulate the tumorigenic properties of CRC cells, and that DLL4 contributes to sustain Notch activity in DLL4-expressing tumors. Further studies are necessary to clarify the role of Notch3 in metastasis and design effective target therapies.

E’ ormai noto da alcuni anni che un’aberrante attivazione della via di segnalazione di Notch gioca un ruolo critico nella patogenesi della leucemia linfoblastica acuta a cellule T (T-ALL) e di alcune neoplasie solide come il cancro del polmone, della mammella e dell’ovaio. Inoltre, una marcata attivazione del recettore Notch1 è stata osservata negli adenomi intestinali ed è correlata all’aumentata espressione del ligando Jagged-1 indotta dall’attivazione del pathway Wnt-APC-β-catenina. E’ stato inoltre dimostrato che questa pathway, insieme a quella di Notch, interviene nella regolazione della proliferazione e del differenziamento delle cellule epiteliali della mucosa intestinale normale. Attualmente, non si sa ancora se altri meccanismi di attivazione della pathway di Notch, oltre a quello ligando-dipendente, siano operativi nel CRC e nemmeno se possano essere coinvolti altri recettori della stessa famiglia. In questo studio, abbiamo cercato di chiarire il possibile coinvolgimento di Notch3 nel CRC. Basandoci sull’osservazione che Notch3 risulta essere frequentemente overespresso sia a livello di mRNA che di proteina nei campioni umani di CRC, abbiamo cercato di chiarire come il recettore Notch3 potesse modulare le proprietà tumorigeniche delle cellule di CRC. A tale scopo, si sono rivelati particolarmente utili alcuni xenotrapianti di cellule umane di CRC che presentano una diversa aggressività in topi NOD/SCID. Infatti, utilizzando i tumori sperimentali, abbiamo potuto dimostrare che l’espressione dei diversi componenti del pathway di Notch risulta essere significativamente elevata nella variante aggressiva rispetto a quella dormiente. In particolare si è osservata un’ aumentata espressione dei ligandi DLL4 e Jagged-1 ed un incremento dei livelli del trascritto di Notch3 e della forma attiva del recettore nei tumori che crescono più rapidamente. Una simile up-regolazione di Notch3 con un’aumentata attivazione della via di segnalazione si è osservata in seguito a stimolazione delle cellule di CRC in vitro con il ligando DLL4 ricombinante. Analogamente, anche l’overespressione di una forma attiva del recettore Notch3 in queste stesse cellule conferisce loro una maggiore capacità proliferativa e favorisce la formazione di tumori in vivo. Al contrario, si è visto che l’inattivazione del pathway mediante silenziamento genico di Notch3 nelle cellule aggressive di CRC, determina significative alterazioni del ciclo cellulare con conseguente riduzione nella proliferazione in vitro e un ritardo nella crescita dei tumori in vivo. Complessivamente, questi risultati dimostrano che il recettore Notch3 può modulare le proprietà tumorigeniche delle cellule di CRC, in particolare contribuendo a mantenere elevata l’attivazione della via di Notch nei tumori esprimenti nel loro microambiente tumorale alti livelli di DLL4. Inoltre, l’inoculo della variante più aggressiva rispetto a quella dormiente per via endovenosa in topi NOD/SCID ha mostrato che le cellule di CRC non hanno solo una diversa capacità tumorigenica, ma anche una differente capacità metastatica a livello polmonare, sia in termine di numero che di dimensioni delle metastasi osservate. Basandoci sui risultati fin qui ottenuti, e su uno studio recentemente pubblicato in cui è stato dimostrato come il pathway di Notch sembra essere coinvolto anche nel processo di metastatizzazione, abbiamo condotto un primo esperimento pilota che prevedeva, in topi portatori di metastasi polmonari, il blocco dei recettori Notch3 e Notch2 mediante l’impiego di un anticorpo neutralizzante. Sfortunatamente i risultati ottenuti non hanno fino ad ora mostrato una riduzione significativa nel numero e nelle dimensioni delle metastasi analizzate: l’analisi dei livelli di alterazione di Notch dopo il trattamento è in corso. A conclusione dello studio le nostre osservazioni rappresentano un punto di partenza per un futuro sviluppo di terapie che abbiano Notch3 come bersaglio per il trattamento di un sottogruppo di casi di CRC.