Fosfo-tirosin-fosfatasi (PTPs): trasduttori positivi e negativi delle vie del segnale mediate da recettori di membrana

The tyrosine phosphorylation in eukaryotic proteins is a key event for transducing enviromental cues into cellular responses ranging from cell-to-cell communication to proliferation, differentiation, cell death and survival. This mechanism of signal transduction is mediated by the opposing and concerted action of Protein Tyrosin Kinases (PTKs), which add phosphoryl groups to target proteins, and Protein Tyrosin Phosphatases (PTPs), which remove them; both classes of enzymes can take part in activatory and inhibitory signalling processes. Tyrosin phosphorylation calls also into action the Src-homology 2 domain (SH2), which is contained in a myriad of proteins with varied functions and that directs protein-protein interaction by “sensing” the phosphorylated state of tyrosine residues, taking part in the modulation of signal transduction. This three-part system has recently been baptized as the “writer “ (PTK), “eraser” (PTP) and “reader” (SH2) tollkit, emphasizing how the combination and dynamic interplay of the elements can generate diverse and complex regulatory outputs. The aim of this work was to determine how the tyrosine phosphorylation is involved in the cellular response to extracellular signals; we investigated the events which trigger an altered pathway in diseases, mainly the role of non-receptor PTPs in three different pathological conditions. In Polycytemia Vera (PV) and Essential Thrombocythemia (ET), which are Philadelphia-negative myeloproliferative disorders (Ph-MPDs), our results demonstrate that in resting platelets the dephosphorylation of the Src-Tyr527 is due the SHP-2 constitutive activity, a non-receptor PTPs, leading to the Src preactivation. The anomalous activation of the kinase is implicated in the hypersensivity of Ph-MPDs and likely involved in the functional abnormalities of PV and ET platelets. In Heparin-Induced-Thrombocytopenia (HIT), immunological reaction that lead to the activation of FcγRIIA in platelets, we have not identified any correlation between the polymorphisms of receptor and HIT, but our results demonstrate that the phosphorylation of FcγRIIA-ITAM motif is due the type of ligand and that influences the responses in the platelets. We stimulated normal platelets with either IV.3, functional blocking antibody against FcγRIIA, or complexes of IgG molecules, and we have not highlighted phosphorylation of the ITAM or aggregation, but we observed a mildly shape change. Interestingly, the pre-incubation of the platelets with PTP-1B, the largest PTPs in platelets, in association with IV.3 and IgG as agonists, leads to phosphorylation of the ITAM and to aggregation. This mechanism may be involved in the clearance of IgG-containing complexes from the circulation by platelets. Finally, we demonstrate for the first time that the PDGF (platelet-derived growth factor)-induced proliferation in epatic stellate cells (HSCs), primary effector cells in liver fibrosis, is mediated by the PTPs SHP-2 and SHP-1: SHP-2 acts as positive regulator of PDGF-dependent signalling, whereas SHP-1 is a negative regulator and lead to the dephosphorylation of the PDGF-receptor. An altered activity and/or expression of these two PTPs causes an inhibited cell proliferation of HSCs, thus they may be a target for new antifibrotic therapies for patients with liver fibrosis. The three pathological models analyzed in this work highlight the key role of PTPs in signalling pathways; they are not to be trivially dismissed as negative regulators because they can organize cellular responses to different stimulations. Furher studies on PTPs-induced signalling regulation may identify new pharmacological therapies

La fosforilazione tirosinica di proteine degli organismi eucarioti è il meccanismo chiave di trasduzione del segnale indotto da stimoli ambientali a livello cellulare, e si esplica in eventi di proliferazione, differenziazione, morte cellulare e sopravvivenza. Questo processo è mediato dall’azione concertata di protein tirosin chinasi (PTKs), che trasferiscono un gruppo fosfato alle proteine bersaglio, e protein tirosin fosfatasi (PTPs), che lo rimuovono; entrambe le classi di questi enzimi possono prender parte ad eventi attivatori e inibitori del signalling. La fosforilazione in tirosina determina il coinvolgimento anche del dominio SH2 (Src-homology 2 domain), presente in numerose proteine con svariate funzioni, che coordina l’interazione proteina-proteina proprio grazie ai residui tirosinici fosforilati, prendendo quindi parte alla modulazione del segnale di trasduzione. Il sistema formato da PTKs, PTPs e dominio SH2 è noto come “writer” (PTK), “eraser” (PTP) e “reader”(SH2) tollkit, denominazione che vuole sottolineare come la relazione e la combinazione di questi tre elementi riesca a determinare una fine e complessa regolazione a livello di signalling. Questo lavoro di tesi intende esaminare il coinvolgimento della fosforilazione tirosinica nel mediare le risposte cellulari a diversi stimoli extracellulari e valutare quali sono i fattori responsabili della sua alterazione in determinate situazioni patologiche ed in particolare il ruolo delle PTPs non recettoriali in tre specifiche patologie. In Policitemia Vera (PV) e Trombocitemia Essenziale (ET), disordini mieloproliferativi Philadelphia-negative (Ph-MPDs), i nostri dati dimostrano che la mancata fosforilazione del sito inibitorio, Y527, della tirosin chinasi Src in piastrine non stimolate è dovuto alla costitutiva attivazione di SHP-2, una PTP non recettoriale, determinando una forma pre-attivata di Src. Questa forma di Src è implicata nella ipersensibilizzazione piastrinica ed è responsabile, almeno parzialmente, delle funzionalità anormali delle piastrine di PV e ET. Nella Trombocitopenia Indotta da Eparina (HIT), reazione autoimmune che porta all’attivazione del recettore FcγRIIA piastrinico, pur non avendo evidenziato una correlazione tra il polimorfismo del recettore e HIT, noi abbiamo indagato il diverso stato di fosforilazione della sequenza ITAM di FcγRIIA e conseguente risposta piastrinica in relazione al tipo di ligando. Stimolando infatti le piastrine di donatori con l’anticorpo monoclonale IV.3, noto per essere un inibitore di FcγRIIA, e con delle IgG complessate, non abbiamo evidenziato fosforilazione dell’ITAM del recettore nè aggregazione, anche se le piastrine vanno incontro ad un cambiamento di forma. In presenza però dell’inibitore di PTP1B, la fosfatasi più abbondante in questo tipo di cellule, gli stessi stimoli portano alla fosforilazione di ITAM e le piastrine vanno incontro ad aggregazione. Questo meccanismo potrebbe essere implicato nel ruolo svolto dalle piastrine nella clereance dei complessi contenenti IgG presenti in circolo. Infine noi abbiamo dimostrato per la prima volta che la risposta proliferativa dopo stimolazione di PDGF (platelet-derived growth factor) delle cellule stellate epatiche (HSCs), principali cellule coinvolte nella fibrosi epatica, è mediata dalle fosfatasi SHP-2 e SHP-1: SHP-2 partecipa come trasduttore positivo del segnale mediato da PDGF, mentre SHP-1 ha effetto negativo sul segnale mediato da PDGF catalizzando la defosforilazione del recettore di PDGF. L’alterazione della loro attività e/o espressione porta ad una inibizione della proliferazione cellulare di HSCs, perciò entrambe le fosfatasi si propongono come possibili bersagli di potenziali farmaci antifibrotici. In tutti i modelli patologici studiati, è chiaro che le PTPs rivestono un ruolo fondamentale nel signaling cellulare; la loro presenza non solo non ha significato esclusivamente negativo ma è necessaria per organizzare la risposta a diversi tipi di stimolo. Lo studio della regolazione del signaling indotto dalle PTPs potrebbe quindi aprire strade alternative per individuare nuove terapie farmacologiche