Administration of L-citrulline in an animal model of perinatal lung damage

Moderate hyperoxia and induced chorioamnionitis by intrauterine administration of endotoxin LPS into near-term pregnant rats cause alveolar and vascular lung derangement in the newborns. Endogenous nitric oxide (NO), which promotes lung growth, is produced from the metabolism of L-arginine to L-citrulline in endothelial cells. We investigated whether administering L-citrulline by raising the serum levels of L-arginine and enhancing NO endogenous synthesis, attenuates lung injury in a chorioamnionitis and/or moderate hyperoxia-induced model. Material and Methods. Newborn rats (receiving or not intrauterine LPS) were exposed to FiO2=0.6 or room air till 14 days after birth and were administered L-citrulline. Serum and lung tissues were collected for further analysis. The lung sections were subsequently stained with H&E and photomicrographs were obtained at 10X magnification. For vessel density assessment, sections were stained to reveal the presence of von Willebrand Factor Antigen. VEGF and eNOS protein expression was examined by Western blot. High performance liquid chromatography-mass spectrometry was used for simultaneous determination and quantification of ADMA, SDMA, L-arginine, L-citrulline, NMMA and homo-arginine in the serum. Results. The lung histopathology analysis of the Hyperoxia group showed a pattern typically emphysematous, similar to the LPS exposure group, when compared to controls. Exposure to hyperoxia was associated with an arrested alveolarization, inducing a change in lung morphology with patchy areas of parenchymal thickening interspersed with areas of enlarged air spaces. The lung sections of the CITR+hyperoxia and LPS+CITR rats contained smaller and more numerous air spaces, and were more similar to the control lungs. The mean alveolar size was higher in Hyperoxia group vs. controls, or LPS+CITR, in a post hoc comparison unchanged with respect to CITR+hyperoxia, or LPS, or CITR. The secondary crests were higher in the Control and CITR+hyperoxia and LPS+CITR groups than in the Hyperoxia only, or LPS only groups. VEGF gene expression evaluated by real-time quantitative PCR was lower in the Hyperoxia group, than in the CITR+hyperoxia or Control groups. Also, lung sections from Control and CITR+hyperoxia animals showed a similar vWF expression, whereas staining was weaker in the Hyperoxia group. In the CITR+hyperoxia sections there was also evidence of a better organization of the vessel network than in animals exposed to hyperoxia. The amount of eNOS protein normalized in the lung tissue from the L-citrulline treated animals was higher than in the tissues from the Hyperoxia group. Serum assessment with mass spectrometry did not show major differences in the time course and treatment groups. Conclusions. Our main findings were that: (i) administering L-citrulline proved effective in improving alveolar growth after oxygen-induced and antenatal endotoxin exposure lung damage; (ii) VEGF gene and protein were over-expressed in the group treated with L-citrulline. There may have been further protective effects on the alveolar vascular network and, consequently, on matrix maturation in our model and this may be promising with a view to BPD prevention strategies.

La corioamnionite indotta dalla somministrazione intrauterina dell’endotossina LPS e da una moderata iperossia nei primi giorni di vita causano uno squilibrio alveolare e vascolare del polmone nel ratto neonato. L’ossido nitrico (NO) endogeno, che promuove la crescita polmonare, viene prodotto nelle cellule endoteliali dal metabolismo del L-arginina verso il suo prodotto, la L-citrullina. Abbiamo studiato l’efficacia della somministrazione di L-citrullina in un modello di danno indotto da corioamnionite e/o da iperossia nei ratti neonati nell’attenuare il danno polmonare intervenendo sulla sintesi del NO endogeno aumentando i livelli di L-arginina. Materiali e Metodi. I ratti neonati (che ricevono o no LPS nella loro fase intrauterina) vengono esposti a un FiO2=0.6, o ad aria ambiente, per 14 giorni dopo la nascita con la somministrazione, per alcuni di loro, della L-citrullina. A vari time-points sperimentali siero e tessuto polmonare vengono raccolti per ulteriori analisi. Le sezioni polmonari vengono colorate con ematossilina & eosina e fotografate a 10X. Per una valutazione della densità vascolare le sezioni sono colorate per la presenza dell’antigene del Fattore di von Willebrand. La VEGF e l’espressione proteica eNOS vengono esaminati con il Western blot. La HPLC Spettrometria di Massa viene usata per determinare e quantificare nel siero ADMA, SDMA, L-arginina, L-citrullina, NMMA e omo-arginina. Risultati. L’esposizione a moderati regimi di iperossia era associata istologicamente con aree estese di tipo enfisematoso, simile al quadro del gruppo esposto al LPS e, inoltre, con un arresto dell’alveolarizzazione e contestuale variazione eterogenea della morfologia polmonare, e ha indotto un cambiamento nella morfometria polmonare con aree irregolari di inspessimento parenchimatoso intervallate da aree con spazi aumentati. Il gruppo ricevente il farmaco presentava un grado di alveolarizzazione più sviluppata con un incremento del numero degli alveoli per mm2, statisticamente significativo rispetto al gruppo con iperossia. Le sezioni polmonari dei gruppi CITR+iperossia e LPS+CITR contenevano spazi più piccoli e più numerosi, simili ai controlli. Il numero delle creste secondarie era più alto nei controlli e nei gruppi CITR+iperossia e LPS+CITR, che nei gruppi con iperossia solo, o LPS sola. L’espressione genica del VEGF era più bassa nel gruppo dell’iperossia, rispetto al gruppo CITR+iperossia, o ai controlli. Inoltre, le sezioni polmonari da animali di controllo o da trattati con CITR+iperossia presentavano un’espressione vWF simile, mentre la colorazione era più bassa nel gruppo con iperossia. Nei campioni da animali trattati con CITR+iperossia era evidente anche un organizzazione migliore della rete vascolare rispetto agli animali esposti solo all’iperossia. La quantità delle proteine eNOS normalizzate nei tessuti polmonari da animali trattati con L-citrullina era più alta che nei tessuti del gruppo con sola iperossia. La valutazione con spettrometria di massa dei campioni di siero non ha mostrato grandi differenze tra i gruppi trattati. Conclusioni. In conclusione abbiamo provato che: (i) la somministrazione della L-citrullina aiuta la crescita alveolare nel danno polmonare da ossigeno, o da esposizione antenatale a endotossina; (ii) il gene e la proteina VEGF sono over-espressi nel gruppo trattato con L-citrullina. Ulteriori effetti protettivi potranno essere manifesti sul network alveolare e vascolare del polmone e, di conseguenza, sulla maturazione della matrice nel nostro modello di danno polmonare; tutto questo potrà essere promettente in vista di una strategia della prevenzione della broncodisplasia polmonare.