Studio dei microRNA associati ad infezione da papillomavirus.

ABSTRACT MicroRNAs (miRNAs) play an important role in tumorigenesis. Several viruses alter cellular miRNA expression to survive in the host by inducing cell proliferation and inhibiting apoptosis. Some recent studies have shown an alteration of miRNAs expression in HPV-positive cervical carcinoma cell lines and in HPV-positive keratinocyte raft cultures. Aim of this study was to identify cellular miRNAs involved in human papillomavirus (HPV) oncogenesis and to characterize their functional activity within the normal human keratinocytes and within cervical carcinoma cell lines. We investigated cellular miRNAs whose expression was altered by HPV E6 and E7 oncoproteins by using miRNA microarrays and qRT-PCR. The expression of miR-34a was significantly downregulated by HPV16 E6, in agreement with its role as p53 effector. In addition, we demonstrated that HPV16 E7 induces the expression of other miRNAs of the miR-34 family, i.e., miR-34b and miR-34c, as well as miR-15b, miR-16, and miR-486-5p, while it inhibits the expression of miR-22, miR-29b, and miR-29c. E6 and E7 also exert opposite effects on the expression of some cellular miRNAs, like miR-146a, which was inhibited by E6 and induced by E7. In cervical carcinoma cell lines, miR-146a expression was very low. At variance, E6 an E7 of HPV6, a low-risk HPV, did not significantly alter host miRNAs expression. To verify a correlation with HPV infection, expression of these miRNAs was analyzed in a group of cervical cytology specimens and in a group of penile carcinoma and condyloma specimens. In these samples, we confirmed that oncogenic HPV infection was associated with a significant reduction of miR-34a/b/c, miR-218, miR-210, and let-7 family miRNA expression. In addition, considering expression of high-risk HPV E6/E7 mRNA, and not only the presence of high risk HPV DNA, we observed that the presence of the viral transcripts was significantly associated with miR-34a down-regulation, but not with miR-34b and miR-34c down-regulation. MiRNA expression was also investigated in a series of penile squamous cell carcinomas (30% positive for high-risk HPVs) and condylomas (all positive for low risk HPVs). In these samples, miR-34a levels were higher in carcinomas than in condulomas; miR-218 was higher in HPV-positive carcinomas than in HPV-negative carcinomas; in addition, miR-146a levels where lower in p16INKa-positive samples (a marker of oncogenic HPV infection) than in p16INKa-negative samples and, accordingly, high-risk HPV-positive samples than in negative samples. In normal keratinocytes and in cervical carcinoma cell lines, miR-146a over-expression significantly inhibited cell proliferation and cell migration. Inactivation of transcription factor binding sites in the miR-146a promoter by site-specific mutagenesis, we demonstrate that miR-146a repression in HPV16 E6 expressing keratinocytes was mainly mediated by c-Myc. Through inactivation, this study identified the microRNAs modulated by HR-HPV E6 and E7 oncoproteins and confirmed their abnormal expression in HR-HPV infected cervical and penile clinical samples. This study also characterized the antiproliferative activity of miR-146a on human keratinocytes and the down-regulation of miR-146a by HR-HPV E6.

RIASSUNTO I microRNA giocano un ruolo fondamentale nella cancerogenesi. Molti virus modificano l’espressione dei microRNA cellulari per sopravvivere al interno della cellula ospite inibendo l’apoptosi cellulare e stimolando la proliferazione cellulare. Studi recenti hanno dimostrato l’alterazione del espressione di alcuni microRNA in linee del carcinoma della cervice uterina positive per papilloma virus umano (HPV) ed in colture organotipiche di cheratinociti umani positivi per HPV. Lo scopo di questo studio è stato l’identificazione di microRNA cellulari coinvolti nell’oncogenesi dal HPV e la caratterizzazione funzionale della loro attività in cheratinociti umani normali e in linee cellulari di cancro del collo dell’utero. Abbiamo quindi ricercato tramite miRNA microarray e qRT-PCR i microRNA cellulari, la cui espressione è modificata dalle oncoproteine E6 ed E7 di HPV. E’ stata dimostrata la significativa soppressione dell’espressione del miR-34a da parte di HPV16 E6, in accordo con i dati della letteratura e con il suo ruolo di effettore di p53. E’ stato inoltre dimostrato che E7 di HPV16, invece, induce l’espressione di altri miRNA della famiglia miR-34, ovvero il miR-34b ed il miR-34c-5p, oltre ai miR-15b, miR-16 e miR-486-5p, mentre inibisce l’espressione dei miR-22, miR-29b e miR-29c. E6 ed E7 di HPV16 esercitavano inoltre un effetto opposto sull’espressione di alcuni microRNA cellulari, tra cui il miR-146a, inibito da E6 e indotto da E7. Inoltre, l’espressione del miR-146a è risultata praticamente assente nelle linee cellulari di carcinoma del collo dell’utero. Al contrario, i geni E6 ed E7 di HPV6, un HPV a basso rischio oncogeno, non hanno portato a alterazioni significative nell’espressione di alcun microRNA cellulare. L’espressione di questi microRNA è stata analizzata in casistiche di campioni citologici cervicali e di carcinomi e condilomi del pene per verificarne la correlazione con l’infezione da HPV oncogeni. In questi campioni è stato confermato che l’infezione da HPV oncogeni si associa ad una significativa riduzione dell’espressione dei miR-34a/b/c, a miR-218, miR-210 e dei microRNA della famiglia let-7. Tuttavia, considerando l’espressione dei trascritti E6/E7 degli HPV ad alto rischio, e non la sola presenza di DNA di HPV ad alto rischio, si è osservato che la presenza dei trascritti virali si associava alla down-regulation del miR-34a, ma non dei miR-34b e miR-34c. Nel 30% dei carcinomi squamosi del pene analizzati in questo studio sono state rilevate sequenze genomiche di HPV , mentre tutti i condilomi erano positivi per gli HPV a basso rischio HPV6 o HPV11. In questi campioni, i livelli di miR-34a erano più elevati nei carcinomi che negli adenomi; il miR-218 era più elevato nei carcinomi HPV-positivi che in quelli negativi; inoltre, i livelli di miR-146a erano più bassi nei campioni p16INKa-positivi (marcatore di infezione da HPV oncogeni) che in quelli p16INKa-negativi e, in accordo, nei campioni positivi per HPV-oncogeni che in quelli negativi. Nei cheratinociti normali e nelle linee cellulari di cervico-carcinoma, la sovraespressione del miR-146a ha portato ad una significativa riduzione della proliferazione e della migrazione cellulare. Infine, mediante mutagenesi sito-specifica nel promotore del miR-146a, è stato dimostrato che nei cheratinociti la repressione dell’espressione del miR-146a da parte di E6 di HPV16 è mediata principalmente da c-Myc. In conclusione, questo studio ha portato all’identificazione dei microRNA modulati dalle oncoproteine E6 ed E7 degli HR-HPV e ne ha confermato l’anomala espressione in campioni clinici cervicali e penieni con infezione da HR-HPV. Questo studio ha inoltre caratterizzato l’attività antiproliferativa nei cheratinociti del miR-146a, il quale è down-regolato da E6 di HR-HPV.