Role of TGFβ signaling in embrionic development and as regulator of Hypoxia in metastasis progression

The focus of my PhD work has been centered on the biological roles of TGFβ signaling in vivo. In particular, I concentrated on the mechanisms at the basis of two of the most critical aspects of this pathway: TGFβ as master of cell fate decisions in early embryonic development and the mechanism by which TGFβ serves as prometastatic factor in tumor cells. The definition of embryonic potency and induction of specific cell fates are intimately linked to the tight control over TGFβ signaling and, surprisingly, little is known on the intracellular factors that negatively control Smad activity in mammalian tissues. By means of genetic ablation (gene-knockout), we found that the Smad4 ubiquitin-ligase Ectodermin (Ecto, also known as Tif1γ) is required to limit TGFβ responsiveness in early mouse embryo. This analysis represents a novelty because prior of this work all the available mouse genetic models concentrated on positive element of this pathway (TGFβ ligands, receptors, Smads). Here we found that negative regulation of Smad is as important as their activation: loss of Ecto invariably drives Smad activity to the highest threshold; new phenotypes, linked to excessive TGFβ activity, emerge from such a modified landscape of Smad responsiveness. In the second part of my thesis I focused instead on a mechanism that cancer cells adopt to induce metastasis downstream of TGFβ. We had previously identified p63 as metastasis suppressor (Adorno et al., 2009), whose function is opposed by TGFβ, and here we asked about the nature of p63 metastasis suppression in Triple Negative Breast cancer (TNBC), whose malignancy is known to be driven by autocrine TGFβ production. By interrogating TNBC clinical datasets, we found that Hypoxia-Inducible-Factors (HIFs), key regulators of the invasive and metastatic cancer cell phenotype are unleashed by p63 inactivation. The p63 target Sharp1 is at the center of this crosstalk. Sharp1 inhibits invasive cell behaviors in vitro and acts as metastasis suppressor in vivo through inhibition of HIF-1α/HIF-2α. Mechanistically, Sharp1 promotes HIF-1α/HIF-2α proteasomal degradation by serving as HIFs presenting factor to the proteasome. Importantly, this process is independent of pVHL, hypoxia and the ubiquitination machinery. As such, Sharp1 is a required determinant for the intrinsic instability of HIFs proteins acting in parallel to and cooperating with oxygen levels. This work sheds light on the mechanisms and pathways by which TNBC acquire invasiveness and metastatic propensity.

Durante il mio peridodo di dottorato mi sono occupata di studiare il ruolo biologico della via di segnale TGFβ in vivo. In particolare mi sono concentrata su due meccanismi critici di questa via di segnale: TGFβ come principale regolatore del destino cellulare durante i processi di formazione dell'€™embrione e come fattore prometastatico nelle cellule tumorali. La regolazione della pluripotenza e l'€™induzione di specifici percorsi di differenziamento cellulare sono intimamente connessi a uno stretto controllo della via di segnale del TGFβ. Pochissimo è noto sull'importanza di fattori che controllino in modo negativo l'€™attività  delle Smad nelle cellule dei tessuti di mammifero. Con questo studio, utilizzando tecniche di ablazione genetica, dimostriamo che l'inibizione di Smad4 da parte di Ectodermin/Tif1γ/TRIM33 (Ecto) è richiesta per permettere a Nodal (il principale ligando TGFβ durante lo sviluppo embrionale di mammifero) di svolgere le sue funzioni morfogenetiche. La delezione di Ecto sposta le risposte Smad4 dipendenti nella finestra di massima responsività . Inoltre, la delezione di Ecto ristretta all'€™epiblasto incanala il differenziamento del mesoderma verso destini di nodo, mostrando come sia necessaria un'€™inibizione di Smad4 per permettere l'€™allocazione ordinata di cellule ai vari destini lungo la stria primitiva. Nella seconda parte della mia tesi mi sono focalizzata sullo studio dei meccanismi, indotti da TGFβ, che promuovono la metastasi. In particolare, tramite analisi bioinformatica su librerie di dati provenienti da tumori alla mammella tripli negativi, abbiamo identificato quali vie di segnale guidano la crescita metastatica in questa classe di tumori così vasta ed eterogenea. A valle di TGFβ abbiamo identificato p53-mutante\p63 e la via di HIFs (Hypoxia-inducible-Factor), già  noti come principali regolatori del comportamento metastatico e invasivo delle cellule tumorali. Al centro di questo quadro si pone Sharp1, indotto da p63 e in grado di inibire l'€™azione di HIF inducendo la degradazione di HIF stesso tramite il proteasoma, in modo indipendente da ubiquitina e pVHL. Sharp1 è quindi un fondamentale freno contro l'€™attività  di HIF che coopera con l'€™ipossia.