The prorenin receptor in the adrenal gland: expression, localization, signalling pathway and potential role in primary aldosteronism

Primary aldosteronism (PA) comprises about 11% patients referred to specialized centers for Arterial Hypertension. A considerable part of them carry a bilateral adrenocortical hyperplasia, also known as, idiopathic hypertension, which require life-long medical treatment. Notwithstanding this high prevalence rate the mechanisms leading to PA are unknown. However, anecdotal reports suggest that prorenin levels could be increased in PA, although the low or undetectable levels of active plasma renin, plasma prorenin levels could be increased. This suggests a possible role of prorenin in the pathophysiology of PA. The discovery of the prorenin receptor (PRR) in 2002, show a new way forward to the pathophysiology of the renin-angiotensin system: PRR can bind renin and prorenin inducing respectively an increase in renin catalytic activity and a non-proteolytically activation of prorenin. Till that discovery, prorenin was only seen as the inactive precursor of renin. Preprorenin is converted to prorenin in the juxtaglomerular cells of the kidney. The cleavage of the amino terminal 43-amino acid prosegment allows exposure of the active site in the secretory granules where generate renin. However the majority (75%) of prorenin is secreted constitutively; therefore The prorenin levels of human blood plasma are approximately 10-fold higher than those of renin. Further, they are increased in several conditions, including diabetes mellitus, where they could play a pathophysiologic role. PRR binding triggers activation of the mitogen activated protein (MAP) kinase–extracellular signal regulated kinase (ERK)1/2 and p38 signalling pathway independent from a possible generation of angiotensin II (Ang II). Activation of these signalling pathways, that are associated with cell proliferation and cell death has led to hypothesize that renin and prorenin could lead, via PRR, to hypertrophy and hyperplasia and ultimately to organ damage and cardiovascular events. In this study we first evaluated the gene and protein expression of PRR in adrenal gland and founded high expression of the PRR mRNA in APA, in human normal adrenal cortex and two human adrenocortical carcinoma cell lines: H295R and HAC15. Then, we sought for the expression of the PRR at the protein level with immunohystochemistry experiments on rat and human normal adrenal gland and with immunocytochemistry experiments. These experiments revealed a strong immunostaining for PRR in the adrenal gland at medulla and sub capsular level, and in aldosterone-secreting cells from the normal human ZG obtained by immunoseparation. In order to localize PRR we carried out immunoblot experiments on HAC15 and H295R cytosolic and membrane fractions and confocal microscopy experiments. These results showed that, PRR is mainly, but not exclusively, localized at the membrane level where partially colocalizes with the adhesion molecule CD56. We then investigated the subcellular localization of the PRR by immuno-gold electron microscopy experiments, and found that PRR is localized also in the nucleus, mitochondria and Golgi’s vesicles. We used H295R and HAC15 cell lines to investigate the functional relevance of this receptor. Stimulation with angiotensin II [100 nM], renin [50 nM] and prorenin [50 nM] induced ERK 1/2 phosphorylation. The renin and angiotensin II induced phosphorylation was abolished in presence of the angiotensin II (AT1) receptor antagonist irbesartan [5 μM] in both cell lines, whereas the phosphorylation induced by prorenin was abolished only in the H295R cells. These results suggest a role of PRR in proliferation, differentiation, and apoptosis of adrenal cortex and, therefore, a functional role of PRR in the pathophysiology of PA.

L’iperaldosteronismo primario (PA) colpisce l’11.2% dei pazienti ipertesi inviati ai centri dell’Ipertensione. Una quota considerevole di essi presenta un’iperplasia bilaterale del surrene, nota anche come iperaldosteronismo idiopatico, che richiede una terapia medica per tutta la vita. Nonostante l’alta prevalenza di questa patologia i meccanismi che ne stanno alla base sono tuttora sconosciuti. Tuttavia dati aneddotici suggeriscono che nel PA, a differenza dei livelli plasmatici di renina che sono ridotti o indosabili, i livelli di prorenina potrebbero essere aumentati. Ciò suggerisce la possibilità che la prorenina giochi un ruolo nella fisiopatologia del PA. Nel 2002 la scoperta del recettore della prorenina (PRR) ha aperto una nuova finestra sulla fisiopatologia del sistema renina-angiotensina: il PRR può legare sia la renina che la prorenina inducendo, rispettivamente, un aumento nell’attività catalitica della renina e un’attivazione non proteolitica della prorenina. Fino ad allora la prorenina era considerata solo il precursore inattivo della renina. La preprorenina viene convertita a prorenina nelle cellule juxtaglomerulari renali. Il clivaggio del prosegmento amino-terminale della prorenina permette l’esposizione del sito attivo nei granuli secretori generando renina. Tuttavia, la maggior parte (75%) della prorenina viene secreta costitutivamente; pertanto i livelli plasmatici di prorenina nell’uomo sono 10 volte maggiori di quelli della renina. Essi sono inoltre aumentati in diverse condizioni, tra cui il diabete mellito, dove potrebbero svolgere un ruolo fisiopatologico. Il legame di renina e prorenina al PRR attiva vie di signalling quali MAP (mitogen activated protein) chinasi-ERK 1/2 (extracellular signal regulated kinase) e p38 indipendentemente dalla generazione di angiotensina II (Ang II). Queste vie sono implicate nella proliferazione e apoptosi, il che ha fatto ipotizzare che renina e prorenina possano indurre ipertrofia e iperplasia e quindi danno d’organo ed eventi cardiovascolari via PRR. In questa ricerca abbiamo valutato l’espressione genica e proteica del PRR nel surrene e scoperto elevati livelli di espressione di mRNA del PRR negli APA, nella corteccia surrenalica umana normale e in due linee cellulari di carcinoma corticosurrenalico umano: H295R e HAC15. Abbiamo quindi investigato la presenza e localizzazione del PRR a livello proteico mediante immunoistochimica su surrene di ratto e umano e immunocitochimica. Ciò ha evidenziato un marcato immunostaining del PRR nel surrene, a livello midollare e sub capsulare, e in cellule di ZG umana secernenti aldosterone ottenute mediante immunoseparazione. Per localizzare il PRR, sono stati condotti esperimenti di immunoblot su frazioni di cytosol e membrana di cellule HAC15 e H295R ed esperimenti di microscopia confocale. Questi risultati hanno mostrato che il PRR è principalmente, ma non esclusivamente, localizzato a livello di membrana ove colocalizza parzialmente con la molecola di adesione CD56. Attraverso esperimenti di microscopia confocale immunogold abbiamo poi indagato la localizzazione subcellulare del PRR e scoperto che il PRR è localizzato anche nel nucleo, nei mitocondri e nelle vescicole del Golgi. Abbiamo quindi utilizzato H295R e HAC15 per studiare la rilevanza funzionale di questo recettore. La stimolazione con angiotensina II [100 nM], renina [50 nM] e prorenina [50 nM] ha indotto fosforilazione di ERK 1/2. In presenza dell’antagonista del recettore dell’angiotensina II (AT1) irbesartan [5 μM], la fosforilazione indotta da renina e angiotensina II era abolita in entrambe le linee cellulari mentre quella indotta dalla prorenina era abolita solo nelle H295R. Questi risultati suggeriscono un ruolo del PRR nella proliferazione, differenziamento e apoptosi del corticosurrene e quindi un possibile ruolo funzionale di questo recettore nella fisiopatologia dell’iperaldosteronismo primario.