MicroRNAs: from biogenesis to post-transcriptional regulatory networks

The discovery of microRNA-based post-transcriptional regulation of gene expression added a novel level of genetic regulation to a wide range of biological processes. Dysregulation of miRNAs expression plays a critical role in the pathogenesis of genetic and multifactorial disorders and of most human cancers. To bypass limitations of computational predictions of miRNA–target relationships, we developed a method for integrated analysis of miRNA and gene expression profiles in combination with target prediction, allowing the identification and study of post-transcriptional regulatory networks in specific biological contexts. This methodology was also implemented in a web tool, MAGIA, that allows integrating target predictions and miRNA and gene expression profiles for the miRNA–mRNA bipartite networks reconstruction, gene functional enrichment and pathway annotations for results browsing. Network analysis has been applied to highlight the importance of some regulatory elements in the regulatory network reconstructed calculating the drop of network efficiency caused by node deactivation. Biologically relevant results, obtained by bioinfomatic analyses in the frame of different projects, were the starting point for further experimental studies, which identified key miRNA-target relations in cancerogenesis. miRNAs biogenesis is not still completely understood. Thus with the integration of genomic information with sequence and expression data we studied the strand selection bias and the expression behavior of intragenic miRNAs and host genes. In contrast with classical biogenesis model, these analyses highlighted that 5’ and 3’ miRNA strands, the “major” and the “minor” forms, deriving from the same hairpin precursor may co-coordinately contribute to silencing of different sets of target genes. Indeed, the behaved tendency to co-expression of intragenic miRNAs and their “host” mRNA genes was confuted by expression profiles examination, suggesting that the expression profile of a given host gene can hardly be a good estimator of co-transcribed miRNA(s) for post-transcriptional regulatory networks inference. In the last year, short RNAs massive sequencing was exploited for a miRNOme analysis of myeloproliferative neoplasms (MPN). This analysis allowed the characterization of short RNAs (known and novel miRNAs, isomiRs and moRNAs) expressed by SET2 cells, a JAK2-mutated cell line model for MPN. moRNAs (microRNA-offset RNA) derived from extended hairpin stem sequences, probably by alternative nuclear and/or cytoplasmic processing. They seem to be conserved across species and the conservation extent correlates with expression level. This evidence suggests that moRNAs might be miRNA co-products, representing a distinct functional class of miRNA-related agents. In conclusion, our analyses were addressed to shed light on the complexity of microRNA-mediated gene regulation, pointing out the regulatory importance of post-transcriptional phases of miRNAs biogenesis, reinforcing the role of such layer of miRNA biogenesis in miRNA-based regulation of cell activities in physiology and in different disease.

La scoperta della regolazione post-trascrizionale dei miRNA ha aggiunto un nuovo livello alla regolazione genetica in numerosi processi biologici. Alterazioni nell’espressione dei miRNA possono giocare un importante ruolo nell’insorgenza di svariate patologie ed in particolare in molte neoplasie. Per ovviare alle limitazioni presenti nelle relazioni miRNA-mRNA degli algoritmi di predizione computazionali, è stata sviluppata una metodologia per l’integrazione dei profili d’espressione di miRNA e mRNA con le predizioni dei bersagli biologici dei miRNA, che ha permesso l’identificazione di reti regolative post-trascrizionali in diversi contesti biologici. Questa metodologia è stata inoltre implementata in un “web-tool”, soprannominato MAGIA. Per evidenziare l’importanza di alcuni elementi regolativi presenti nei circuiti biologici è stata applicata la teoria delle reti per l’identificazione di geni critici attraverso la loro de-attivazione nella rete. I frutti di queste analisi bioinformatiche, svolte nell’ambito di numerosi progetti, hanno rappresentato il punto di partenza per successivi studi sperimentali che hanno portato alla scoperta di rilevanti relazioni miRNA-target in specifici tumori. La biogenesi dei miRNA non è stata ancora completamente chiarita, perciò, integrando informazioni derivanti dalle sequenze genomiche e da dati d’espressione, sono stati approfonditi alcuni loro aspetti, quali la teoria di generazione dei miRNA maturi per selezione del filamento e la co-espressione dei miRNA intragenici e dei loro geni ospiti. Le suddette analisi hanno evidenziato che i miRNA generati dal 5’ ed il 3’, derivanti dallo stesso miRNA precursore, supportano solo parzialmente il modello classico della biogenesi dei miRNA, secondo il quale uno dei due miRNA maturi è scelto in modo deterministico e degradato. Entrambe le forme “major” e “minor”, infatti, possono contribuire insieme al silenziamento di gruppi diversi di geni bersaglio. La tendenza alla co-espressione tra i miRNA intragenici e i loro geni ospiti, inoltre, è stata confutata dall’analisi dei loro profili d’espressione, dimostrando che i profili d’espressione dei geni ospite non possono essere usati come stimatori dell’espressione dei miRNA per l’inferenza di reti regolative post-trascrizionali. Nell’ultimo anno, il sequenziamento massivo di brevi RNA è stato sfruttato per l’analisi approfondita di miRNA nelle neoplasie mieloproliferative. Attraverso questo approccio è stato possibile scoprire e caratterizzare numerosi brevi RNA, quali miRNA noti e nuovi, isomiRNA e i moRNA, che sono espressi nelle cellule SET2, linee cellulari con mutazione del gene JAK2. I moRNA (microRNA-offset RNA) derivano dalle sequenze dei precursori dei miRNA, probabilmente da un processo alternativo del nucleo e/o citoplasmatico, e sembrano essere conservati in varie specie. Il loro grado di conservazione è correlato con i livelli d’espressione e si potrebbe dedurre che siano prodotti insieme ai miRNA, ma rappresentando una classe funzionale distinta da essi. In conclusione, le nostre analisi sono state indirizzate a far luce sulla complessità della regolazione dei geni da parte dei miRNA, in particolare sull’importanza delle fasi post-trascrizionali della biogenesi dei miRNA ed il loro ruolo nella regolazione delle attività cellulari fisiologiche ed in diverse patologie.