In vitro and in vivo studies of bioresorbable electrospun scaffolds for vascular tissue engineering: on the effectiveness of blending poly(epsilon-caprolactone) with poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)

The structure of a blood vessel is relatively simple; its main structural component is a layer of smooth muscle cells (SMCs) embedded in a collagen matrix. The interior lumen of the vessel is lined with endothelial cells (ECs), who form the interface between the flowing blood and the vessel wall. The outer layer of the tube is covered with fibroblasts (FBs) and connective tissue (Seunarine et al.,2008). Although autologous arterial and venous grafts represent the best clinical option to bypass or replace blood vessels that became stenosed by disease processes or trauma, several limitations affect this practice, being related to pre-existing vascular disease, prior surgery, limited length or poor quality (Pektok et al., 2008; Nottelet et al., 2009). Conventional vascular prostheses made of expanded polytetrafluoroethylene (ePTFE) or polyethyleneterephtalate (Dacron) are currently used to overcome the above reported limitations, being shelf-ready and available only for large blood vessel replacement. Tissue engineering (TE) is an alternative approach for the preparation of small-diameter vascular grafts (<6 mm) due to the potential to control thrombosis, cellular hyperplasia and matrix production. This control also requires the maintenance of graft patency in vivo, appropriate mechanical properties and the formation of a functional endothelium (Zhang et al., 2009). This topic represents a crucial issue to be addressed in order to overcome the drawbacks of small-diameter grafts and offer potentially growing devices for pediatric surgery. TEVGs needs a compliant polymer scaffold to which endothelial cells (ECs) can adhere, form an anti-thrombogenic monolayer and exhibit vasoactive properties (Williamson et al., 2006). For a new tissue to be generated or regenerated it requires a porous scaffold which acts as substratum for cell attachment in order to obtain a construct able to adapt to the host modifications to improve the clinical outcome after graft implantation. An ideal scaffold should have good biocompatibility and biodegradation characteristics. It should also have appropriate biomechanical properties, good saturability to ensure secure implantation, and availability in a variety of size for a wide range of grafting applications (Tillman et al., 2009). The electrospinning technology is efficient and cost-effective to produce polymeric mats and vascular grafts with definite characteristics to control their degradation during remodeling and to reproduce a suitable cell environment able to mimic the physical and structural properties of native extracellular matrix (ECM) (Baiguera et al., 2009). Bioresorbable polymeric scaffolds produced by electrospinning are among the most promising materials due to their similarity to the native extra cellular matrix (ECM) (He et al., 2009). The poly(epsilon-caprolactone) (PCL) is a synthetic aliphatic polyester, intensively investigated biomaterial; its advantages are ease of fabrication, pliability, and tunable mechanical strength. It can be produced to conduits with the required dimensions, optimum porosity and viscoelasticity (Pankajakshan et Agrawal, 2010). However, its generally poor cell affinity due to hydrophobicity, lack of cell-binding signals and its slow degradation rate in vivo (Nottelet et al., 2009) have become the major obstacle to be an ideal tissue engineering material (Xiang et al., 2011). Consequently PCL blended with natural polymers could be a promising approach in vascular tissue engineering (Pankajakshan et Agrawal, 2010). Moreover, blend of synthetic and natural polymers have shown good cytocompatibility with mesenchymal stem cells (Tang et Wu, 2005). The poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBV) is a natural material produced by numerous bacteria. Its in vivo degradation involves the release of hydroxy acids, less acid and less inflammatory than other bioresorbable polymers (Williams et Martin, 2002). Its various properties such as natural origin, biodegradability, biocompatibility, non-toxicity (Ke at al., 2010) make it a good candidate for blending with PCL. Starting from these assumptions, in this project soft PCL, already approved by the Food and Drug Administration, hard PHBV and their intimate blend PCL/PHBV (50% PCL/50% PHBV) were considered. The electrospun bioresorbable polymeric mats and tubular scaffolds were designed, produced and characterized at the University of Rome "Tor Vergata", Department of Science and Chemical Technology, by Prof. Alessandra Bianco and Eng. Costantino Del Gaudio. In the first step of the work, cytocompatibility studies were addressed. Sprague-Dawley rat endothelial cells from two different compartments, cerebral endothelial cells (RCECs) and aortic endothelial cells (RAECs) were seeded on polymeric mats and samples cut out from tubular scaffolds of small caliber (inner diameter <6 mm) in in vitro static culture to assay adhesion, viability and proliferation. The biological results have shown that the mats based on PCL allowed the survival and better growth of RCECs. In case of samples cut out from the tubular structures of PCL and PCL/PHBV, the RCECs have covered the surface of scaffolds by organizing themselves into a monolayer as in the native blood vessel. On the contrary, the RAECs have grown steadily and have also colonized mats and samples cut out from the tubular scaffolds of PHBV. In the second step the PCL, PHBV and PCL/PHBV mat biocompatibility has been evaluated by implanting them in vivo in the Sprague-Dawley rat dorsal subcutaneous tissue for 7, 14 and 28 days. All rats survived and all explanted mats were integrated into the host tissue, were partially vascularized and preserved their appearance and shape. The PHBV mat explants folded during the time lapse but their form was conserved. Explanted polymeric mat sections, stained with hematoxylin and eosin, showed a complete PHBV and PCL/PHBV fibrous capsule resorption at 28 days. The inflammatory cell infiltrate decreased over time whereas migratory cells increased. They colonized the border area and the polymeric mat inner part. The results obtained in vitro and in vivo experiments suggest the blend PCL/PHBV as a possible alternative material to the PCL in the field of vascular tissue engineering, thanks to its intermediate characteristics between synthetic (PCL) and natural (PHBV) material and thanks to a more rapid in vivo degradation and remodeling compared to PCL

La struttura di un vaso sanguigno e' relativamente semplice essendo principalmente composto da uno strato di cellule muscolari lisce (SMCs) incorporato in una matrice di collagene. Il lume interno e' rivestito da cellule endoteliali (ECs) che costituiscono l'interfaccia tra il flusso sanguigno e la parete del vaso. Lo strato esterno e' ricoperto da fibroblasti (FBs) e da tessuto connettivo (Seunarine et al., 2008). Sebbene impianti autologhi di arteria e di vena rappresentino la migliore opzione clinica per il bypass o la sostituzione di vasi sanguigni stenotici a causa di processi patologici o traumi, diversi limiti influenzano questa pratica, in particolare malattie vascolari preesistenti e la limitata lunghezza o la scarsa qualita' dei sostituti (Pektok et al., 2008; Nottelet et al., 2009). Protesi vascolari in politetrafluoroetilene espanso (ePTFE) o Dacron sono attualmente utilizzate con successo per superare i limiti sopra riportati e per il bypass di condotti vascolari di medio e grande calibro, superiore a 6 mm. L' ingegneria tissutale dei sostituti vascolari (TEVGs) e' un approccio alternativo per la costruzione di vasi di piccolo diametro (<6 mm) con la possibilita'  di controllare fenomeni di trombosi, iperplasia cellulare ed eccessiva produzione di matrice. Inoltre, in vivo devono essere assicurati il mantenimento della pervieta'  del graft e di adeguate proprieta'  meccaniche e la formazione di un endotelio funzionale (Zhang et al., 2009). Questo argomento rappresenta una questione cruciale da affrontare per superare gli inconvenienti dei sostituti di piccolo diametro e per poter usufruire di questi anche nel settore della chirurgia pediatrica. Tale approccio si basa sull' utilizzo di uno scaffold polimerico poroso a cui le cellule endoteliali (ECs) possano aderire cosi' da formare un monostrato antitrombogenico con proprieta'  vasoattive (Williamson et al., 2006). Obbiettivo finale e' la realizzazione di un costrutto trapiantabile in grado di adattarsi alle modifiche dell' ospite. Lo scaffold ideale dovrebbe essere dotato di buona biocompatibilita' e biodegradabilita' . Esso dovrebbe inoltre disporre di adeguate proprieta'  biomeccaniche e di ampia disponibilita'  di svariate dimensioni per una vasta gamma di applicazioni cliniche (Tillman et al., 2009). Con la tecnica dell' elettrospinning si ottengono supporti polimerici per sostituti vascolari con particolari caratteristiche: degradazione controllata durante il rimodellamento in vivo, riproduzione di un ambiente adatto alla crescita cellulare e in grado di mimare le proprieta'  fisiche e strutturali della matrice extracellulare (ECM) nativa (Baiguera et al., 2009). Le matrici polimeriche biodegradabili prodotte con la tecnica dell' electrospinning, sono tra i materiali piu' promettenti, grazie alla loro somiglianza alla matrice extracellulare (ECM) (He et al., 2009). Il poli(epsilon-caprolattone) (PCL) e' un poliestere alifatico, ampiamente studiato come biomateriale; i suoi vantaggi sono la facilita' di fabbricazione, la duttilita'  e l' elevata resistenza meccanica. Puo' essere prodotto come scaffold tubulare con le dimensioni richieste e con porosita'  e viscoelasticita'  ottimali (Pankajakshan et Agrawal, 2010). Tuttavia, la sua generalmente scarsa affinita' cellulare, dovuta all' idrofobicita' , la mancanza di molecole segnale e la sua lenta degradazione in vivo (Nottelet et al., 2009) sono aspetti che precludono la sua considerazione come materiale ideale per l' ingegneria tissutale (Xiang et al. 2011). Di conseguenza, la realizzazione di un blend di PCL con polimeri naturali potrebbe essere un approccio promettente nel campo dell'ingegneria tissutale vascolare (Pankajakshan et Agrawal, 2010). Inoltre miscele di polimeri sintetici e naturali hanno gia'  mostrato buona citocompatibilita'  con cellule staminali mesenchimali (Tang et Wu, 2005). Il poli (3-idrossibutirrato-co-3-idrossivalerato) (PHBV) e' un materiale naturale prodotto da numerosi batteri. La sua degradazione in vivo comporta il rilascio di idrossiacidi, meno acidi e meno infiammatori rispetto ad altri polimeri bioriassorbibili (Williams et Martin, 2002). Le sue varie proprieta'  quali l'origine biologica, la biodegradabilita' , la biocompatibilita' , la non tossicita'  (Ke et al., 2010) ne fanno un buon candidato per la realizzazione di blend con PCL. Partendo da tali presupposti, in questo progetto sono stati valutati i seguenti materiali: soft poli(epsilon-caprolattone) (PCL), di origine sintetica e gia'  approvato dalla Food and Drug Administration, hard poli(3-idrossibutirrato-co-3-idrossivalerato) (PHBV), di origine microbica, e il loro blend PCL/PHBV (50% PCL/50% PHBV). Le matrici polimeriche e gli scaffold tubulari elettrofilati sono stati progettati, prodotti e caratterizzati presso l'Universita'  di Roma "Tor Vergata", Dipartimento di Scienze e Tecnologie Chimiche, dalla Prof. Alessandra Bianco e dall'Ing. Costantino Del Gaudio. Nella prima fase del lavoro, e' stata testata la citocompatibilita'  su matrici e su scaffold ricavati da strutture tubulari di piccolo calibro (diametro interno<6mm) tramite saggi in vitro utilizzando cellule endoteliali di ratti Sprague-Dawley da due diversi distretti: microcircolo cerebrale (RCEC) ed aorta (RAEC). Sono stati effettuati saggi di adesione, di vitalita'  e di proliferazione che hanno dimostrato che le matrici a base di PCL permettono la sopravvivenza e la migliore crescita delle RCEC. Nel caso di scaffold ricavati da strutture tubulari di PCL e PCL/PHBV, le RCEC hanno ricoperto la superficie dei polimeri organizzandosi in un monostrato come nei vasi sanguigni nativi. Diversamente dalle RCEC, le RAEC sono cresciute costantemente e hanno colonizzato anche le matrici e gli scaffold ricavati da strutture tubulari di PHBV. Nella seconda fase del lavoro e' stata valutata la biocompatibilita'  delle matrici polimeriche di PCL, PHBV e PCL/PHBV mediante l' impianto in vivo nel tessuto sottocutaneo dorsale di ratti Sprague-Dawley per 7, 14 e 28 giorni. Tutti i ratti sono sopravvissuti e tutti i polimeri espiantati sono apparsi conservati nel loro aspetto e forma. La colorazione con ematossilina ed eosina ha dimostrato il completo riassorbimento della capsula fibrosa a 28 giorni, sui polimeri di PHBV e di PCL/PHBV. L' infiltrato cellulare infiammatorio e' diminuito nel tempo mentre e' aumentato il numero di cellule migranti che hanno colonizzato la zona di confine tra tessuto e matrice e in parte l' interno di quest' ultima. I risultati ottenuti in vitro ed in vivo sembrano indicare il blend PCL/PHBV come possibile materiale alternativo al PCL nel campo dell' ingegneria tissutale vascolare sia per le caratteristiche intermedie tra PCL, di origine sintetica, e PHBV, di origine naturale rispettivamente, sia per la degradazione e il rimodellamento piu' rapidi in vivo rispetto al PCL