Mineralocorticoid receptor activation, insulin sensitivity and adipose tissue: analysis of their inter-relationship in human and experimental models

STUDY IN PADOVA Analysis of insulin sensitivity in adipose tissue of patients with primary aldosteronism Objective: To assess a possible role of visceral adipose tissue in the pathogenesis of insulin resistance in primary aldosteronism. Methods: Visceral adipose tissue was obtained from patients with aldosterone-producing adenoma (APA; n=14) and, as controls, non-functioning adenoma (NFA; n=14) undergoing laparoscopic adrenalectomy. Homeostasis model assessment index was higher and potassium was lower in APA than in NFA patients (P<0.05). Immunohistochemistry, Western blotting and real-time PCR were used to detect and quantify mineralocorticoid receptor (MR) expression. Transcript levels of peroxisome proliferative-activated receptor-g, insulin receptor, glucose transporter 4, insulin receptor substrate (IRS)-1, IRS-2, leptin, adiponectin, interleukin-6, monocyte chemoattractant protein-1, glucocorticoid receptor (GR)a, 11b-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (HSD11B1) and 2 were quantified. The effects of increasing aldosterone concentrations on 2-deoxy-[3H]d-glucose uptake and expression of insulin signaling intermediates were tested in human subcutaneous abdominal adipocytes. Results: Expression of MR was demonstrated in VAT, with no difference between APA and NFA as to mRNA levels of MR, GRa, HSD11B1, as well as glucose metabolism and inflammation factors. In cultured adipocytes, basal and insulin-stimulated glucose uptake were unaffected by 1-100 nM (normal/hyperaldosteronism) and impaired only by much higher, up to 10 mM, aldosterone concentrations. The impairment was prevented by RU486 but not by eplerenone in insulin-stimulated glucose uptake. Conclusions: No alteration of gene expression of insulin signaling or inflammatory molecules was present in VAT of APA patients. Only at pharmacological concentrations and through GR activation did aldosterone reduce glucose uptake in adipocytes. Systemic insulin resistance in primary aldosteronism might occur in compartments other than fat and/or depend on concurrent environmental factors. STUDY IN PARIS. Phenotypic and metabolic characterization of a new double transgenic mouse model, conditionally overexpressing the human mineralocorticoid receptor in adipocytes Objective: to explore the specific effects of mineralocorticoid over activation in the adipose tissue, through the phenotypic and metabolic characterization of a new double transgenic mouse model doxycycline-inducible, conditionally overexpressing the human mineralocorticoid (hMR) receptor in adipose tissues. Methods: Subcutaneous inguinal adipose tissue (SAT), brown adipose tissue (BAT), visceral epididymal adipose tissue (EVAT) and visceral retroperitoneal adipose tissue (PVAT), were obtained from double transgenic mice (DT; n=8) and their wild type control littermates (wt; n=9) after hMR transgene induction with doxycycline. Adipocytes primary cultures were set up from EVAT and SAT of DT and wt mice. Transcript levels of hMR, endogenous mouse MR (mMR), neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL), Plasminogen activator inhibitor-1 (Pai1), MCP1, tumor necrosis factor α (TNFα) and PPARγ, were quantified by qRT-PCR. Analysis of mouse transcriptome in PVAT was performed by microarray. Results: HMR was found specifically expressed in all adipose tissues, but it was significantly overexpressed, as compared to mMR, only in PVAT, SAT and BAT. A preliminary qRT-PCR analysis revealed an hMR-overexpression-associated increase of NGAL mRNA. Transcriptome analysis reported that MR overexpression in PVAT allowed 101 genes to be up-regulated and 246 to be down-regulated in DT mice. The geneontology analysis showed that an extra dose of MR in lean mice promotes adipogenesis and hinders inflammation by up regulating genes involved in fatty acid and PPAR pathways and down regulating those involved in immune system activation. Cultured DT adipocytes showed an efficient tet-On adipo-MR system and preliminary data confirm a significantly higher expression of NGAL in DT adipocytes. Conclusions: Preliminary results are open to further investigations on DT-MR model. The next steps will be: 1) to evaluate the changes in the metabolic phenotype of DT mice overfed with a high fat diet, e.g. glycaemia, insulinaemia, serum free fatty acids and blood pressure; 2) to continue with in vitro experiments in DT adipocytes, in describing regulation of adipokines expression upon stimulation with mineralocorticoid/glucocorticoids agonists and antagonists.

STUDIO A PADOVA Valutazione della sensibilità insulinica nel tessuto adiposo dei pazienti affetti da iperaldosteronismo primitivo Obbiettivo: valutare un possibile ruolo del tessuto adiposo viscerale nella patogenesi dell'insulinoresistenza nell'iperaldosteronismo primitivo. Metodi: Il tessuto adiposo viscerale è stato ottenuto da pazienti con adenoma-producente aldosterone (APA, n = 14) e da pazienti con adenoma non funzionante (NFA, n = 14) sottoposti a surrenectomia laparoscopica. L'indice HOMA era più alto e la concentrazione di potassio era più bassa negli APA rispetto ai pazienti NFA (p <0,05). L'analisi immunoistochimica, il western blotting e la real-time PCR sono stati utilizzati per rilevare e quantificare l'espressione di MR. Tramite qPCR sono stati quantificati anche i livelli trascrizionali di PPAR-γ, IR, GLUT4, IRS-1, IRS-2, leptina, adiponectina, IL6, MCP-1, GRα, HSD11B1 e 2. Su colture di adipociti umani sottocutanei, sono stati testati gli effetti di dosi crescenti di aldosterone sulla captazione del 2-deossi-[3H]-D-glucosio e sull'espressione dei trasduttori intermedi del segnale insulinico. Risultati: L'espressione di MR è stata dimostrata nel VAT. Nessuna differenza è stata rilevata tra i pazienti APA e NFA, nei livelli di MR, GRα, HSD11B1, dei geni del metabolismo del glucosio e dei geni codificanti per i fattori di infiammazione. Negli adipociti in coltura, la captazione del glucosio, basale o insulino-stimolata, è risultata inalterata dalla stimolazione con aldosterone alle concentrazione più basse, 1-100 nM (normale/iperaldosteronismo), mentre è risultata ridotta alla concentrazione più alta di 10 μM. Negli esperimenti, questa riduzione è risultata prevenuta da pretrattamento con RU486, ma non con eplerenone. Conclusioni: Nel VAT dei pazienti APA non è stata trovata alcuna alterazione dell'espressione delle molecole regolatrici del segnale insulinico o dell'infiammazione. L'aldosterone riduce l'assorbimento del glucosio negli adipociti solo a concentrazioni farmacologiche e probabilmente attraverso l'attivazione di GR. L'insulino-resistenza sistemica osservata nell'iperaldosteronismo primitivo potrebbe verificarsi a causa del coinvolgimento di altri organi (oltre che al grasso) e/o dipendere da altri fattori ambientali concomitanti. STUDIO A PARIGI Conseguenze funzionali e molecolari dell’attivazione del recettore umano dei mineralcorticoidi: sovra-espressione nel tessuto adiposo di topo Obiettivo: esplorare gli effetti specifici di una super attivazione del sistema mineralcorticoide nel tessuto adiposo attraverso la caratterizzazione fenotipica e metabolica di un nuovo modello condizionale di topo transgenico (inducibile con doxiciclina), sovraesprimente hMR negli adipociti. Metodi: i tessuti SAT, BAT, EVAT e PVAT, sono stati ottenuti da topi doppio-transgenici (DT; n = 8) e da topi di controllo (wt; n = 9) dopo l'induzione di hMR con doxiciclina. Culture primarie di adipociti sono state allestite dai tessuti EVAT e SAT di topi DT e wt. Tramite qPCR sono stati quantificati i livelli di trascrizione di hMR, mMR, NGAL, Pai1, MCP1, TNFα e PPARγ in tutti i tessuti adiposi. Nel PVAT del topo DT è stata eseguita l'analisi del trascrittoma tramite microarray. Risultati: hMR è risultato specificamente espresso in tutti i tessuti adiposi, ma significativamente sovraespresso, rispetto a MR endogeno, solo nel PVAT, nel SAT e nel BAT. Un primo studio tramite qPCR ha rivelato come a un aumento di espressione di hMR sia sempre associato un aumento di espressione di NGAL nei tessuti adiposi. L'analisi del trascrittoma ha evidenziato inoltre come l'iperespressione di MR nel PVAT del topo DT comporti contemporaneamente l'aumento e la riduzione di espressione di rispettivamente 101 geni e 246 geni. L'analisi genontologica di questa lista ha rivelato come una dose supplementare di MR nei topi DT promuova l'adipogenesi e ostacoli l'infiammazione, in particolare, aumentando l'espressione di geni coinvolti nella regolazione degli acidi grassi e della via del PPARγ e diminuendo l'espressione dei geni coinvolti nell'attivazione del sistema immunitario. Gli adipociti DT in coltura primaria hanno confermato l'efficienza del nostro sistema doppio transgenico anche in vitro e l'analisi preliminare in qPCR conferma anche negli adipociti DT l'aumento di espressione di NGAL. Conclusioni: I risultati preliminari incoraggiano ulteriori indagini sul modello DT. I prossimi passi saranno: 1) valutare le variazioni del fenotipo metabolico dei topi DT sovralimentati con una dieta ricca di grassi, 2) continuare gli esperimenti in vitro negli adipociti DT, valutando le conseguenze della stimolazione con agonisti/antagonisti di MR e GR sull'espressione genica.