Role of TGF-Bs growth factors in development of aortic aneurysms. Study in a mouse model of Marfan syndrome.

This study is a first part of a larger project that concerns analysis of vascular anomalies, in particular aortic aneurysm, in Marfan syndrome (MFS). MFS is a systemic disorder that principally interests skeletal, ocular and vascular systems. Although it is clearly defined that Fbn1 mutations are the principal cause of syndrome manifestation, the pathogenic mechanism of phenotypic alteration, like aortic aneurysm, remains unclear. Since Fibrillin-1 functions as storage of growth factors, the deregulation of TGF-b signaling has been suggested as starting event in manifestation and progression of aortic aneurysm. In accordance with this hypothesis, the study of Marfan mice models, as Fbn1+/C1039G model, having a point mutation corresponding to that found in human subjects, revealed an increase of P-Smad2/3 and of TGF-β target genes expression in aortic aneurysm. However, other findings suggested the involvement of other signaling pathways (Angiotensin II, MAPK), while a role for BMP has never been considered, even if BMP binds Fibrillin-1 and is involved in skeletal alterations of Marfan syndrome. In this work we analyzed activation levels of TGF-β/BMP signaling in Fbn1+/C1039G mice, at different ages and in both aortic arch and descending aorta. Fbn1 mutants showed increase of both signaling at 2 and 4 months, but not at 7 months when aneurysm is observed. Analysis has also highlighted lack of correlation between expression of TGF-β target genes, PAI-1 and Ctgf, and P-Smad2/3 levels in aortic arch in 7-month-old mice suggesting implication of other signaling pathways. Analysis of BMP target genes expression has shown a correspondence between Id2 and phosphorylation levels of Smad1/5/8; instead Id3 was still increased at 7 months, suggesting that its expression at this age may be regulated by other factors. One main effort of the study was the generation of a transgenic inducible expression system, based on Tet-On technology, to modulate TGF-β/BMP signaling in smooth muscle cells of aorta. We generated transgenic mouse lines for reverse tetracycline transactivator (rtTA), controlled by Smmhc promoter, and for responsive constructs (caALK5, caAlk3, Smad7, Smad6, Noggin) under TRE- 7 CMVmin promoter. RT-PCR analysis in vitro in VSMCs and in vivo in aorta of double transgenic mice showed appropriate function of the inducible system and partial correlation between modulated signaling and target gene expression. To address the role of combined TGF-B/BMP signaling in aneurysm development Smad4 was inactivated in smooth muscle cells of adult wild-type and Fbn1 mutant mice using conditional inducible gene knockout. In wild-type mice, inhibition of both signaling pathways caused the appearance of vessel wall damage, aortic arch dilatation and death for dissection within 6 months from gene inactivation induction. Smad4 knockout in smooth muscle cells of Fbn1 mutant mice determined worsening of thoracic aortic aneurysm, with increase of aortic root dilatation and aortic wall damage. Besides, Fbn1+/C1039G mice with Smad4 inactivation, developed also abdominal aortic aneurysm, a finding that was never observed in Fbn1+/C1039G mice. Increase of structural damage in Fbn1 and Smad4 mutants caused early death for dissection, rarely documented in Fbn1+/C1039G mice. These observations suggest a protective role of TGF-β/BMP activity in the formation and the progression of aortic aneurysms. These results will be expanded and supplemented by a detailed molecular analysis of additional signaling pathways that are deemed to play a role in Marfan syndrome.

Lo studio qui presentato, si propone di porre le basi per un progetto che interessa l'analisi delle anomalie vascolari, in particolare aneurisma aortico, nella sindrome di Marfan, malattia sistemica che colpisce principalmente i sistemi scheletrico, oculare e vascolare. Anche se e' ormai dimostrato che anomalie a carico del gene Fbn1, che codifica per una proteina delle fibre elastiche, la Fibrillina-1, sono la causa principale dell'insorgenza della malattia, risulta ancora poco chiara la patogenesi delle alterazioni fenotipiche, in particolare del'aneurisma aortico. Considerando la funzione della Fibrillina-1 come deposito di fattori di crescita, l'ipotesi attualmente piu' accreditata, suggerisce che ci sia una alterata regolazione del segnale di TGF-B alla base della manifestazione e progressione dell'aneurisma aortico. Concordemente a questa ipotesi, l'analisi di modelli animali, come i topi Fbn1+/C1039G, che portano una mutazione puntiforme di una aminoacido frequentemente mutato nella sindrome di Marfan, ha riscontrato un incremento di P-Smad2/3 e di espressione di geni bersaglio di TGF-B a livello dell'aneurisma. Tuttavia, i dati hanno suggerito la possibile implicazione di altre vie di segnale (Angiotensina II, MAPK), mentre non e' stato considerato il ruolo di BMP, un fattore di crescita che lega direttamente la Fibrillina-1 e di cui e' stato prospettato un ruolo nelle alterazioni scheletriche della sindrome. In questo studio abbiamo inizialmente analizzato i livelli di attivazione delle vie del TGF-B e BMP a diverse età a livello dell'arco aortico e nel tratto discendente dell'aorta in topi Fbn1+/C1039G. Nei Fbn1 mutanti, i dati mostrano un incremento del segnale di entrambe le vie a 2 e 4 mesi, ma non a 7 mesi, quando invece l'aneurisma e' presente. L'analisi ha poi evidenziato una mancata correlazione tra i livelli di espressione di PAI-1 e Ctgf, geni bersaglio per TGF-β, e P-Smad2/3 a livello dell'arco aortico a 7 mesi, suggerendo l'implicazione di altre vie di segnale. Per quanto riguarda l'espressione dei geni bersaglio di BMP, è stata osservata corrispondenza tra l‟espressione di Id2 e i livelli di P-Smad1/5/8; Id3 invece, rimane aumentato nei mutanti anche a 7 mesi, evocando, anche in questo caso, la possibilità dell‟intervento di altri fattori. Lo studio ha 9 inoltre previsto la generazione di un sistema di espressione inducibile, basato sulla tecnologia del sistema Tet-On, sensibile alla doxiciclina, per la modulazione delle vie di TGF-β/BMP nella cellule muscolari lisce di aorta (CMLV). Sono state generate linee transgeniche per il transattivatore (rtTA), controllato dal promotore del gene Smmhc, e per i geni bersaglio (caALK5, caAlk3, Smad7, Smad6, Noggin) controllati dal promotore inducibile TRE-CMVmin. Le analisi di RT-PCR in vitro in CMLV ed in vivo in aorta di topi doppi transgenici, hanno evidenziato il corretto funzionamento del sistema inducibile e la parziale correlazione tra via di segnale modulata ed espressione dei geni bersaglio. Contemporaneamente utilizzando la linea transgenica Smmhc-CreERT2 è stata indotta l‟inattivazione del gene Smad4 in topi adulti mutanti e non per Fbn1. L‟inibizione di entrambe le vie di segnale comporta già in topi non mutanti, la comparsa di danno di parete, dilatazione a livello dell‟arco aortico e morte per dissezione aortica entro 6 mesi dall‟inattivazione del gene. Inoltre la mancanza di Smad4 nelle CMLV in topi Fbn1+/C1039G causa un peggioramento dell‟aneurisma toracico, caratterizzato da incremento della dilatazione aortica e del danno parietale. In aggiunta nei topi Fbn1+/C1039G, knockout per Smad4, si sviluppa anche un aneurisma addominale, normalmente mai osservato nei modelli Marfan. L‟incremento del danno strutturale nei topi mutanti per Fbn1 e Smad4 porta a morte precoce per rottura dell‟aneurisma, un evento che si verifica molto raramente nei topi con la sola mutazione di Fbn1. Queste prime osservazioni, che andranno ampliate e affiancate da uno studio molecolare delle vie di segnale sopra menzionate, suggeriscono un effetto protettivo di TGF-β/BMP nella comparsa e progressione di aneurismi aortici. Questa considerazione trova conferma nei dati relativi ad incremento di dissezione ed aneurisma aortico, in seguito ad inibizione di TGF-β, in modelli animali diversi da quello qui analizzato.