The strange case of protein kinase CK2: how a constitutively active enzyme can mediate signal transduction. Lo strano caso della proteinchinasi CK2: come un enzima costitutivamente attivo può mediare la trasduzione del segnale.

Summary Protein kinase CK2 is a Ser/Thr protein kinase composed of two catalytic (alpha and/or alpha’) and two regulatory (beta) subunits. It is ubiquitously expressed, constitutively active, and highly pleiotropic, with more than 300 protein substrates known so far (Meggio and Pinna, 2003); consequently, CK2 plays a key role in several physiological and pathological processes (Pinna, 2002; Ahmed et al., 2002). Unlike the majority of the other protein kinases that are activated in response to specific stimuli by second messengers, phosphorylation events or association with regulatory molecules, CK2 activity is not regulated, thus understanding the mechanism by which it controls cellular events is challenging. Many of the efforts to understand its involvement in signaling pathways are directed to identify cellular substrates that are responsible for mediating its action in cells. This last consideration, together with the fact that the CK2 function in cells is well recognized to be pro-survival and anti-apoptotic, thus related to neoplastic transformation (Ruzzene and Pinna, 2010), has rendered CK2 a reasonable “druggable target” in many different pathologies in which it is involved (Guerra and Issinger, 2008), giving rise to the development of many specific inhibitors, useful not only for investigating its physiological role, but, possibly, also for therapy (Sarno and Pinna, 2008; Pierre et al., 2011). The main issue which gave rise to this work is therefore how can a constitutively active kinase mediate external stimuli, which need to be transient? With this premise, we examined the CK2 involvement in different signaling pathways and in different contexts: I. The role of protein kinase CK2 in the differentiation process of acute promyelocytic leukemia (APL) cells induced by retinoic acid (RA) treatment; II. The role of CK2 in mediating plant response to salicylic acid (SA); III. The CK2-dependent regulation of multimolecular chaperone complexes, under survival/apoptotic conditions, in normal and multidrug resistant (MDR) cells. I. Role of protein kinase CK2 in the differentiation process of APL cells: With this work we demonstrate that the CK2 activity is required for RA-induced APL cells differentiation since CK2 inhibitors block this response. Moreover, being the CK2 catalytic activity unchanged in response to RA, we focused on changes in the substrate phosphorylation pattern. A major change in phosphorylation revealed to concern beta-actin, that was not known as a CK2 substrate before. By means of in vitro kinase assays, we confirmed that actin is phosphorylated by CK2. Moreover, we found that RA induces an increase of beta-actin expression level detectable both in the cytosol and in the nucleus; interestingly, the CK2 inhibition markedly reduced the nuclear beta-actin increase in response to RA, suggesting a role of the CK2-dependent phosphorylation in actin nuclear translocation and its possible involvement in mediating the RA-induced APL cells differentiation. II. Role of protein kinase CK2 in plant response to SA treatment: SA treatment in plants is known to induce a complex cellular response, accompained by the production of nitric oxide (NO), which is prevented by inhibition of CK2 (Zottini et al., 2007). We demonstrated that a major protein phosphorylated in Arabidopsis in response to SA treatment is the homologous of the human co-chaperone protein p23, known to be involved with Hsp90 in the cell chaperone machinery. Our experiments also showed that CK2 (from human and maize) phosphorylates Arabidopsis p23 in vitro with favourable kinetic parameters, and that endogenous Arabidopsis CK2 is the major kinase responsible for the phosphorylation of this protein. Moreover, we demonstrate that CK2 physically associates with p23 in vitro and that the two proteins co-localize in vivo. Although at present we do not know the exact function and effect of p23 phosphorylation. All together our results are consistent with a role of this protein in the requirement of CK2 for plant response to SA. III. The CK2-dependent regulation of multimolecular chaperone complexes, under survival/apoptotic conditions, in normal and multidrug resistant (MDR) cells: For this work we take advantage of a cell model, the CEM cells, which are available in two variants: the S-CEM, normally sensitive to drug-induced apoptosis, and the R-CEM, which are multidrug resistant (Dupuis et al., 2003). This model is particularly interesting since we have previously demonstrated that R-CEM express a higher level of CK2 alpha respect to S-CEM. In these cells, we analysed a specific substrate of CK2, the co-chaperone protein Cdc37, a protein essential in the Hsp90 chaperone machinery committed to protein kinases folding and activation. We found that in the two cell variants, two different isoforms of Cdc37 are expressed: the protein in S-CEM is shorter at the C-terminus than that expressed in R-CEM. These two isoforms display different features: we found that Cdc37 of S-CEM is rapidly degraded in apoptosis, while the isoform of R-CEM is more stable, and, during apoptosis, undergoes the only C-terminal cleavage. Surprisingly, despite the higher amount of CK2 exhibited by R-CEM , the CK2-dependent phosphorylation of Cdc37 Ser13 was not significantly different in the two cell lines. This suggested to us the possibility that, in dependence of the of the isoform expressed, Ser13 is differently accessible to the kinase and/or the phosphatase responsible for its modification. In agreement with this hypothesis, we found that during apoptosis, when the C-terminal part of Cdc37 in R-CEM is cleaved, a dephosphorylation of Ser13 also occurs. Moreover, the two Cdc37 isoforms seems to participate to different multimolecular complexes, as judge by their migration upon density gradient ultracentrifugation, and these complexes are differently susceptible to disruption by chaperone inhibitors. In summary, in apoptosis resistant cells, a more fuctional chaperone machinery is observed, and CK2, expressed at particularly high levels in these cells, might exploit this substrate as a powerful tool to exert its anti-apoptotic function.

Riassunto La proteinchinasi CK2 è un Ser/Thr chinasi composta da due subunità catalitiche (alfa e/o alfa') e due subunità regolatorie (beta). E' ubiquitaria, costitutivamente attiva e altamente pleiotropica con più di 300 substrati noti sino ad oggi (Meggio e Pinna, 2003); proprio per queste sue caratteristiche, CK2 gioca un ruolo chiave in molti processi fisiologici e patologici (Pinna, 2002; Ahmed et al., 2002). Diversamente dalla maggior parte delle altre chinasi, che in risposta a stimoli specifici sono attivate da secondi messaggeri, fosforilazioni o associazione con molecole regolatorie, l’attività di CK2 non è regolata, e questo rende particolarmente impegnativa la comprensione dei meccanismi tramite i quali essa controlla i diversi processi cellulari. Molti degli sforzi al riguardo sono diretti all’identificazione di substrati cellulari responsabili del suo intervento in tali processi. Queste considerazioni ed il fatto che è largamente riconosciuto il ruolo anti-apoptotico e pro-sopravvivenza che CK2 riveste nelle cellule, quindi legato alla trasformazione neoplastica (Ruzzene e Pinna, 2010), hanno reso CK2 un interessante bersaglio farmacologico nelle varie patologie nelle quali è stata riconosciuta avere un ruolo (Guerra e Issinger, 2008). Sono stati infatti sviluppati molti inibitori specifici per CK2, non solo allo scopo di studiare il suo ruolo fisiologico, ma anche, potenzialmente, per uso terapeutico (Sarno e Pinna, 2008; Pierre et al., 2011). La domanda principale che ha dato origine a questo lavoro di tesi è stata quindi: come può una chinasi costitutivamente attiva mediare stimoli esterni, che, per loro nature, devono essere transitori? Con queste premesse, abbiamo quindi studiato il coinvolgimento di CK2 in differenti contesti e vie di segnalazione. I tre principali argomenti descritti in questa tesi sono: I. Ruolo di CK2 nel differenziamento di cellule di leucemia promielocitica acuta (APL) in risposta ad acido retinoico (RA); II. Ruolo di CK2 nella risposta delle piante al trattamento con acido salicilico (SA); III. Regolazione da parte di CK2 di complessi chaperone multimolecolari, in condizioni di sopravvivenza ed apoptosi, in cellule normali e farmacoresistenti (MDR) I. Ruolo di CK2 nel differenziamento di cellule di leucemia promielocitica acuta (APL) in risposta ad acido retinoico (RA): Con questo lavoro, abbiamo dimostrato che l’attività di CK2 è necessaria per il differenziamento indotto da RA delle cellule di leucemia promielocitica acuta, infatti l’inibizione di CK2 blocca tale risposta cellulare. Inoltre, abbiamo dimostrato che l’attività catalitica di CK2 non è influenzata dal trattamento; abbiamo pertanto focalizzato la nostra attenzione su possibili variazioni di fosforilazione dei suoi substrati. Il principale cambiamento èstato osservato nel grado di fosforilazione della beta-actina, una proteina mai annoverata sino ad ora tra i substrati di CK2. Attraverso saggi di fosforilazione in vitro, abbiamo confermato che l’actina è effettivamente un substrato di CK2. Abbiamo potuto inoltre appurare che il trattamento con RA induce un aumento dell’espressione della beta-actina, individuabile sia a livello citosolico che nucleare; particolarmente interessante è risultato il fatto che l’inibizione di CK2 riduce fortemente tale incremento a livello nucleare, suggerendo un ruolo della fosforilazione di CK2 nella traslocazione della beta-actina nel nucleo e, di conseguenza, la sua possibile importanza nel mediare l’effetto di RA sul differenziamento delle cellule APL. II. Ruolo di CK2 nella risposta delle piante al trattamento con acido salicilico (SA); Il trattamento con SA, nelle piante, è noto indurre una risposta di varia natura, accompagnata dalla produzione di ossido nitrico (NO), che viene però a mancare qualora CK2 sia inibita (Zottini et al., 2007). Con questo studio in Arabidopsis, abbiamo dimostrato che la principale proteina che viene fosforilata in risposta al trattamento con SA, è p23, una proteina omologa alla p23 umana che è un co-chaperone noto per essere coinvolto, con Hsp90, nel macchinario delle “chaperonine”. I nostri risultati hanno dimostrato che CK2 (umana e di mais) fosforilano p23 di Arabidopsis in vitro con parametri cinetici favorevoli, e inoltre, che la CK2 endogena di Arabidosis è la principale chinasi responsabile della fosforilazione di questa proteina. Abbiamo anche dimostrato che CK2 e p23 possono interagire fisicamente in vitro e che hanno, in vivo, la stessa localizzazione subcellulare. Al momento non conosciamo la funzione di p23 e l’effetto della sua fosforilazione, ma, nell’insieme, i nostri dati sono coerenti con un suo ruolo nel mediare l’azione di CK2, in risposta all’SA nelle piante. III. Regolazione da parte di CK2 di complessi chaperone multimolecolari, in condizioni di sopravvivenza ed apoptosi, in cellule normali e farmacoresistenti (MDR): In questo lavoro ci siamo serviti del modello cellulare costituito dalle cellule CEM, che avevamo disponibili in due varianti: le S-CEM, che sono sensibili all’apoptosi indotta da farmaci, e le R-CEM, che sono invece farmacoresistenti (Dupuis et al., 2003). Questo modello è particolarmente interessante, in quanto abbiamo dimostrato in precedenza che le cellule R-CEM esprimono un livello più elevato della subunità catalitica di CK2 rispetto alle S-CEM. In queste cellule, abbiamo analizzato un substrato specifico di CK2, la proteina co-chaperone Cdc37, che è essenziale nel macchinario chaperone di Hsp90 diretto al folding ed all’attivazione di proteinchinasi. Abbiamo visto che le due linee cellulari esprimono due isoforme diverse di Cdc37: le S-CEM esprimono una isoforma più corta al C-terminale rispetto all’isoforma presente nelle R-CEM. Le due isoforme dimostrano inoltre di avere caratteristiche diverse: quella delle S-CEM è rapidamente degradata in apoptosi, mentre l’isoforma delle R-CEM è più stabile e, in apoptosi, è sottoposta al taglio del solo C-terminale. Sorprendentemente però, nonostante l’elevata espressione di CK2, nelle R-CEM, il livello della fosfo-Ser13, che è il residuo fosforilato in maniera specifica da CK2 in Cdc37, non è significativamente diverso nelle due linee cellulari. Questo ci ha suggerito l’ipotesi che, a seconda dell’isoforma espressa, la Ser13 sia diversamente accessibile alla chinasi e/o alla fosfatasi responsabili della sua modificazione. In accordo con ciò, abbiamo infatti osservato che in apoptosi, quando il C-terminale di Cdc37 delle R-CEM viene tagliato, si assiste anche alla defosforilazione della Ser13. Inoltre, le due isoforme sembrano partecipare a complessi multimolecolari diversi, come appurato tramite centrifugazione in gradiente di densità, che mostrano anche una diversa sensibilità alla disgregazione indotta da inibitori degli chaperone. Nel complesso, i dati ottenuti suggeriscono che CK2, nelle cellule farmacoresistenti, dove è espressa a livelli particolarmente elevati, può servirsi di Cdc37, che in queste cellule sembra essere più funzionale, come un potente strumento per esplicare la sua funzione anti-apoptotica.