Applicazioni innovative della risonanza magnetica nucleare alle matrici alimentari. Uno studio sul caffè verde.

The quality of green coffee represents the main condition for the production of a good end product at a cup level. Nowadays among the fields which the scientific publications deal with about the green coffee quality there are the development of methodologies for the authenticity assurance, and the study of the most appropriate methods for the water quantification. In the former case, because of the increased diffusion of adulteration practises along the coffee commercial chain, recently the need of rapid methods for coffee autentication is increased. However, the number of developed methods for the geographical origin are still limited; furthermore, the low number of analized samples in all the works carried out about this topic makes the achieved results not sufficiently statistically significant. Ambiguity also remains about the markers to be used for the geographical discrimination of coffee qualities. Thus are required, on the one hand, suitable routine methods to control as many samples as possible, on the other hand a unique set of markers has to be established. In the field of the studies carried out on water the problem of its distribution within the coffee matrix is still open. The understanding of this phanomenon is of great importance, since a correlation between the degree of hydration and the mechanical properties of the green coffee bean has been observed in literature, for instance. The research presented in this PhD work has tried to give answers to open questions mentioned above with the help of the magnetic resonance technique, which has been successfully employed in the food field . In this work two different methods have been developed to achieve the geographical origin determination of green coffee, by using the time domain NMR (TD NMR), and with the help of the high resolution NMR technique combined to multivariate statistical analysis , respectively methods. The first one, based on the time domain NMR has been realized by means of a benchtop analyser operating at a resonance frequency 1H of 20 MHz (Bruker Minispec Mq20), and also enables the fast simultaneous determination of water and oil percents of a high number of samples in a non destructive, and reproducible way, through the NMR spin echo sequence. The percentages of water and oil in the analised samples has beeen obtained by using two distinct calibration lines, respectively . The results obtained by the application of the method on 500 green coffee samples have been subjected to statistical analysis (ANOVA) The obtained results indicate that a good discrimination of the continental origins of the samples is possible by using the oil percent value as a marker. To correctly evaluate water and oil components by means of the spin echo sequence the preliminary analysis of the transverse relaxation times (T2) in the green bean with the help of by using the CPMG NMR sequence. The continous T2 distributions were obtained by inverting the experimental CPMG curves with the Laplace transformation with the help of a suitable Upen program The preliminary assignement of the the t2 mobility populations relative to water phase in the region spanning from 0.1 to 3 ms was achieved by comparing the relaxation profiles of a serie of green beans to the corrisponding profiles of the same ovendried beans The T2 region of the lipid component of the was assigned by comparing either the relaxation profiles of a some green beans at different hydration levels, or by comparing the T2 distribution of the untreated bean with the one of the fresly extracted oil from the same bean. To shed light on the water distribution in green coffee bean, the T2 region, which was previously assigned to water proton mobility, was analised in details by means of systematic gradual rehydration experiments on previously dessiccated coffee beans. The T2 distributions obtained either from manually rehydrated beans either with H2O or D2O up to 35% (dry basis) or, alternatively, wetted by exposure of a controlled air environment, were compared to the untreated beans. Data obtained indicate that up to about 10% water embedded in the bean exhibits a rather restricted mobility, likely as a result of interaction with the cell walls or hydrogen bond formation. Furthermore, the relaxation profiles obtained by rehydrating the dry beans with D2O highlighted the contribution of the proton exchance mechanism to the overall Laplace inversion signal. By the analysis of the profile of water distributions was found that this is determined by the convolution of two distinct proton mobility populations, positioned at 0.5 and 1 ms, respectively. In the green bean as well as in the rehydrated ones, which were analysed, it was found that at hydration levels up to 4%, only the fast relaxing population can be observed (i.e. the one at a lower T2), while at intermediate water contents they are both present. The fast relaxing component could be assigned to the antiplasticization effect of water, while the one which is characterized by a slower relaxation rate may be associated to water plasticizing the macromolecular polymers. In this sense our observation could provide an interpretation in terms of proton mobiliy to the so called antiplasticization effect, which was first discovered at a macroscopic level. The analysis of the T2s distribution of the region assigned to the lipid phase (i.e the one by about 10 ms to about 300 ms) shows a multimodal profile, which in particular suggests the presence of three different proton mobility populations. This observation, which was observed in the green bean as well as in the freshly extracted oil from the same bean, was then confirmed either by analysing the temperature dependence of the components and or by literature. An alternative method for the geographical autentication was also elaborated by means of the multivariate statistical of the NMR resonances obtained either from the organic or the aqueous extracts of 48 samples belonging to di different geographical origins. The obtained data indicate that in the organic extract the fatty acids seem to be effective as a markers for the discrimination the African samples among all the other ones, while the resonances of the minor costituents are able to differentiate all the samples of different origin. In particular kaweohl compound positively correlates with the Brazilian samples, while the caffeine peaks and other minor compounds discriminate the middle American samples from the ones of the south. Finally, other minor costituents characterize African and Asian samples.characterization of acqueous extract throught bidimensional NMR experiments allowed the identification of characteristic spin sistems of the other not identified components. DOSY diffusion experiments were carried out on the acqueous extract of African samples and supported the hypothesis of an interaction occurring between caffein and chlorogenic acids. In particular, the obtained data allow one to suppose that in the aqueous extract of the analized African sample the caffein is present in solution both in the free form and as a complex with the chlorogenic acid.

La qualità del caffè verde rappresenta il principale requisito per la realizzazione di una bevanda apprezzata a livello commerciale. Attualmente tra i vari campi interessati dalla produzione scientifica sulla qualità del caffè verde vi sono lo sviluppo di metodologie per garantire l’autenticità e lo studio delle metodiche più appropriate per la quantificazione dell’acqua. Nel primo caso la necessità di metodi rapidi per l’autenticazione del caffè è divenuta in tempi recenti un’esigenza sempre più pressante a causa della crescente diffusione di pratiche di adulterazione nella filiera commerciale di questo prodotto. Tuttavia sono ancora limitati i metodi formulati per la determinazione dell’origine geografica; inoltre, la bassa numerosità di campioni analizzati nei lavori compiuti in tale ambito rende i risultati trovati non sufficientemente significativi. Rimane infine ambiguità sui possibili markers da utilizzare nella discriminazione. Occorrono da un lato quindi metodi adatti ad analisi routinarie per il controllo del maggior numero possibile di campioni, e dall’altro una scelta univoca di possibili markers per la discriminazione geografica delle varie qualità di caffè. Nell’ambito degli studi compiuti sull’acqua rimane ancora aperta la problematica della distribuzione dell’acqua stessa all’interno della matrice. La comprensione di questo fenomeno è di notevole importanza in quanto è stata osservata ad esempio in letteratura la correlazione fra il grado di idratazione e le proprietà meccaniche del chicco verde. La ricerca presentata in questo dottorato ha cercato di dare una risposta alle problematiche aperte appena descritte con il ricorso alla Risonanza Magnetica Nucleare, recentemente utilizzata con successo in ambito alimentare. In questo lavoro sono stati sviluppati infatti due metodi per la determinazione dell’origine geografica del caffè verde, rispettivamente con l’NMR nel dominio dei tempi, e con l’NMr ad alta risoluzione, quest’ultimo in combinazione con l’analisi statistica multivariata. Il primo metodo, basato sull’NMR nel dominio dei tempi, è stato realizzato per mezzo di uno spettrometro operante alla frequenza di 20 MHz (Bruker Minispec Mq20), e permette la determinazione simultanea delle percentuali di acqua e olio di un elevato numero di campioni in maniera rapida e riproducibile tramite l’utilizzo della sequenza spin echo. I valori delle percentuali di acqua e olio nei campioni sottoposti ad analisi è stato ricavato utilizzando due differenti calibrazioni per l’acqua e per l’olio. Le percentuali di acqua e olio ottenute dall’applicazione del metodo su 500 campioni di caffè verde sono stati sottoposti ad analisi statistica (ANOVA). I risultati ottenuti indicano che una buona discriminazione dei continenti di provenienza dei campioni è possibile utilizzando il valore di percentuale di olio come marker. Per quantificare correttamente le componenti acqua e olio con la sequenza spin echo è stata necessaria l’analisi preliminare dei tempi di rilassamento trasversale (T2) nel chicco verde con l’NMR nel dominio dei tempi mediante l’applicazione della sequenza CPMG. Le distribuzioni continue di tempi di rilassamento trasversale sono state ricavate invertendo con la trasformata di Laplace con l’aiuto del software Upen le curve CPMG ottenute. L’assegnazione preliminare della popolazioni di T2 relative alla fase acqua nella regione compresa fra 0.1 e 3 ms è stata realizzata confrontando i profili di rilassamento di una serie di chicchi verdi con i corrispondenti profili ottenuti per essicazione in stufa. La regione di T2 relativa alla componente lipidica dei chicchi verdi è stata invece assegnata sia confrontando i profili di rilassamento di una serie di chicchi a diversi livelli di idratazione sia confrontando le distribuzioni di T2 nel chicco con quella dell’olio estratto dallo stesso. Allo scopo di far luce sulla distribuzione dell’acqua nel caffè verde la regione della distribuzione di T2 attribuita all’acqua è stata studiata in dettaglio con una serie di esperimenti sistematici di reidratazione graduale di chicchi precedentemente essiccati. Le distribuzioni di T2 ottenute da chicchi essiccati e reidratati manualmente fino al 35% (su base secca) sia con H2O che con D2O e, alternativamente, per esposizione in atmosfera di umidità controllata, sono state confrontate con quelle di chicchi verdi tal quali. I dati ottenuti indicano che fino a circa 10% l’acqua incorporata nel chicco manifesta una mobilità ridotta, in quanto probabilmente adsorbita o legata con le pareti cellulari mediante ponti idrogeno. La reidratazione con acqua deuterata ha evidenziato inoltre il contributo dello scambio protonico al segnale della distribuzione osservato. L’analisi dei profili di distribuzioni dell’acqua ha inoltre portato all’osservazione che questo risulta determinato dalla convoluzione di due popolazioni di mobilità protonica, rispettivamente centrate a circa 0.5 e 1 ms. Sia nel chicco verde che in quelli reidratati è stato trovato che a contenuti di acqua fino a 4% delle due popolazioni è visibile solo quella a mobilità inferiore, mentre a percentuali intermedie sono presenti entrambe. Con riferimento all’articolo di Pittia e collaboratori, la componente a rilassamento rapido potrebbe essere associata all’effetto di antiplasticizzazione dell’acqua, mentre la popolazione caratterizzata da rilassamento più lento può essere correlata all’effetto plasticizzante dell’acqua. In questo senso i nostri dati forniscono una conferma ed un’interpretazione in termini di mobilità protoniche al co-siddetto effetto di antiplasticizzazione, scoperto a livello macroscopico. La distribuzione dei tempi di rilassamento trasversale dei T2 della regione associata ai lipidi (cioè quella compresa fra circa10 ms e circa 300 ms) mostra un profilo multimodale, che suggerisce la presenza di tre diverse mobilità protoniche. Tale osservazione è stata confermata sia con lo studio della dipendenza dalla temperatura delle mobilità protoniche, compiuto sia per la fase lipidica all’interno dei chicchi, sia per l’olio fresco isolato mediante estrazione soxhlet, sia dal confronto con dati di letteratura. Questa osservazione ha trovato inoltre conferma nei dati di letteratura. Un metodo per la discriminazione geografica è stato infine elaborato mediante l’analisi statistica multivariata delle risonanze NMR sia degli estratti organici che acquosi di 48 campioni di caffè verde di diversa provenienza. I dati ottenuti indicano che nell’estratto organico gli acidi grassi sembrano essere efficaci nel discriminare i campioni africani da tutti gli altri analizzati, mentre le componenti minoritarie sono efficaci nella differenziazione tra i campioni con diversa provenienza. In particolare il Kahweolo correla positivamente con i campioni del Brasile, mentre la caffeina e i composti minoritari differenziano i campioni centro americani da quelli del sud America, e altri componenti minoritari non identificati che caratterizzano i campioni africani e quelli asiatici. La caratterizzazione dell’estratto acquoso mediante esperimenti bidimensionali ha permesso inoltre l’identificazione di sistemi di spin caratteristici degli estratti protonici del campioni di caffè brasiliano, quali zuccheri minoritari e isomeri dell’acido clorogenico. Esperimenti di diffusione DOSY condotti sull’estratto acquoso dei campioni di origine africana hanno inoltre avvalorato l’ipotesi di una possibile interazione caffeina/ acidi clorogenici. In particolare i dati ottenuti fanno supporre che nell’estratto acquoso del campione africano analizzato, la caffeina è presente in soluzione sia in forma libera che complessata con l’acido clorogenico.