Association between multiple candidate genes and carcass and beef quality in Pemontese cattle

The consumer is becoming more conscious about the quality of products and he is willing to pay more for superior products. To respond to the new and diversified consumer demand it is necessary to develop animal production with concerns of safe and quality products. Meat quality is a complex concept including carcass composition and conformation, lack of microbiological hazards, animal welfare and environmental impact. Traits concerning beef quality have low/medium heritabilities, and measures are difficult and expensive to be carried out. The development of DNA technologies applied to cattle represents a promising tool suitable to solving these problems. Markers found in various candidate genes linked to quality traits have been identified and included into a commercially genetic test for carcass/beef quality traits. However, before including these candidate genes in genetic tests and using them in breeding programs it is important to perform validation studies in different breeds to establish whether the observed marker effects are found in the breed or population of interest. Aims of this thesis were to analyze a group of candidate genes polymorphisms in order to provide further information about their allelic frequencies in Piemontese population and their association with the main carcass/beef quality traits. A prescreening was carried out to investigate the variability of a set of polymorphisms located in 15 candidate genes for meat quality traits. Meat samples of Longissimus thoracis muscle collected on 1,208 Piemontese young bulls, progeny of 109 AI sire, were available. Phenotypic data for carcass and meat quality traits used included carcass weight (CW), shear force (SF), cooking loss (CL) and pH (pH24h). For each trait, 48 samples were chosen from each tail of the trait distribution. One or more single nucleotide polymorphisms (SNPs) were determined in the following candidate genes: calpastatin (CAST), calpain 1 (CAPN1), B and D cathepsin (CTSB, CTSD), growth hormone (GH), growth hormone receptor (GHR), pro-opiomelanocortin (POMC), pituitary-specific positive transcription factor 1 (POU1F1), melanocortin-4 receptor (MC4R), corticotrophin-realising hormone (CRH), insulin-like growth factor binding protein-3 (IGFBP3), diacylglycerol acyltransferase 1 (DGAT1), thyroglobulin (TG), carboxypeptidase E (CPE), and protein kinase adenosine monophosphate-activated γβ-subunit (PRKAG3). A total of 20 SNPs were genotyped using allele refractory mutation system polymerase chain reaction (ARMS-PCR) or restriction fragment length polymorphism polymerase chain reaction (RFLP-PCR). Allelic frequencies, test for Hardy-Weinberg (HW) equilibrium, as well as genic differentiation for sampled populations (i.e., 2 sub-populations per trait corresponding to the tails of its phenotypic distribution) were obtained using Genepop software version 4.0. A total of 6 SNPs showed a minor allele frequency less than 10%. Samples from the tails of each trait distributions were treated as different populations to investigate any possible difference in allelic frequencies. Only MC4R locus showed a significant difference in the allelic frequency across tails for CW. Based on these results, only variable loci were further investigated (Chapter 3). It was demonstrated that calpain system (μ-calpain, m-calpain, and calpastatin) and a lysosomal enzyme (cathepsin) influence some meat quality traits. In this study, 5 SNPs previously tested: CAPN530 (AF_288054.2:g.4558G>A), CAPN4751 (AF_288054.2:g.6545C>T), CAST2959 (AF_159246.1:g.2959A>G), CAST2870(AF_159246.1:g.2870A>G), CAST282 (AY_008267:g.282G>C) and CTSD (AB_055312:g.77G>A), were investigated in 990 Piemontese young bulls. A univariate Bayesian mixed-inheritance animal model was used to evaluate the effects of genotypes on variation of pH24, lightness (L*), redness (a*), yellowness (b*), cooking loss (CL), drip loss (DL), and shear force (SF). An association was observed only for CAST282 G allele and CAPN530 A allele on DL, CAPN530 A allele was also associated with b* and CAST2959 A allele with a*. It is reasonable to hypothesize that the effect obtained in this study might has been due to a variation of degradation of myofibril proteins and consequently activation/deactivation of drip channel that origin drip losses (Chapter 4). The last 10 variable polymorphisms tested in the prescreening phase were: GH1547 (M57764:g.1547TC>G), GHR257 (AF_140284:g.257A>G), POMC254 (J00021:g.254C>T), POU1F1 208 (EF090615:g.208A>G), MC4R1069 (AF_265221:g.1069C>G), CRH240 (AF_340152:g.240G>C), DGAT10343 (AJ_318490:g.10343GC>AA), TG1696 (M35823:g.1696C>T), CPE601 (AY_970663:g.601C>T), and PRKAG3 1609 (AY_692035:g.1609G>A). All of these SNPs were analyzed to calculate allelic frequency and to test their association with CW, pH24h, L*, a*, b*, CL, DL, and SF. All SNPs were informative in Piemontese population except for CPE601. Bayesian association analysis showed that 8 out of the 10 investigated SNPs had and additive deviation with at least one of the carcass and beef quality traits investigated. Some of these associations were new, whilst others confirmed previous investigations (Chapter 5).

Il consumatore sta diventando sempre più consapevole della qualità dei prodotti alimentari ed è disposto a pagare di più prodotti di qualità superiore. Per far fronte alle nuove e diversificate richieste dei consumatori, è necessario migliorare la produzione animale prestando particolare attenzione alla sicurezza e alla qualità. La qualità della carne è un concetto complesso che include composizione e conformazione della carcassa, assenza di rischi microbiologici, benessere animale e impatto ambientale. I caratteri che influenzano la qualità delle carni bovine hanno ereditabilità medio/bassa e inoltre misurarli è spesso difficile e costoso. Lo sviluppo delle tecnologie basate sul DNA, applicate agli animali da reddito, rappresenta un promettente strumento adatto a risolvere tali problemi. Molti marcatori presenti su geni candidati per la qualità della carne sono stati identificati e inclusi in test disponibili in commercio. Tuttavia prima di utilizzare questi test in programmi di miglioramento genetico è importante valutare se e quali effetti questi geni hanno nella popolazione in cui si vogliono utilizzare. Gli obiettivi di questa tesi sono stati: analizzare un gruppo di polimorfismi di geni candidati, al fine di fornire informazioni sulle loro frequenze alleliche nella popolazione Piemontese e valutarne l’associazione con i caratteri per la qualità della carcassa e della carne. Una pre-analisi è stata eseguita per individuare la variabilità di venti polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) situati su quindici geni candidati per la qualità della carne. I campioni di Longissimus thoracis sono stati prelevati da 1.208 vitelloni Piemontesi, generati da 109 tori del centro d’inseminazione artificiale. Su tali campioni erano disponibili i dati fenotipici per la conformazione della carcassa e per la qualità della carne: peso della carcassa (CW), forza di taglio (SF) perdite di cottura (CL), e pH (pH24). Per ogni carattere, quarantotto campioni sono stati scelti da ciascuna delle due code della distribuzione normale del carattere stesso. Uno o più polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) sono stati determinati nei seguenti geni candidati: calpastatina (CAST), calpaina 1 (CAPN1), B e D catepsina (CTSB, CTSD), ormone della crescita (GH), recettore dell’ormone della crescita (GHR), pro-opiomelanocortina (POMC), POU classe 1 homeobox 1 (POU1F1), recettore della melanocortina-4 (MC4R), ormone corticotropina rilasciante (CRH), proteina legante il fattore di crescita insulino-simile 3 (IGFBP3), diacilglicerolo aciltransferasi 1 (DGAT1), tireoglobulina (TG), carbossipeptidasi E (CPE) e subunità -γβdella proteina chinasi AMP-attivata (PRKAG3). Venti SNPs sono stati sottoposti a genotipizzazione mediante tecniche basate sulla reazione a catena sella polimerasi (PCR). Le frequenze alleliche, il test di equilibrio di Hardy-Weinberg (HW), così come la differenziazione genica per le popolazioni campionate (ovvero, due sub-popolazioni una per ciascuna coda della distribuzione del carattere) sono stati ottenuti utilizzando il software Genepop la versione 4.0. Un totale di sei SNPs ha presentato alleli minori con frequenza inferiore al 10%. I campioni presi delle code delle distribuzioni di ogni carattere sono stati trattati come popolazioni diverse al fine di rilevare eventuali differenze tra le frequenze alleliche. Solo il locus MC4R ha mostrato una differenza statisticamente significativa nella distribuzione allelica tra le due popolazione per il CW. I loci variabili ottenuti da questa prima analisi saranno analizzati su tutto il campione (capitolo 3). E’ stato dimostrato che sia il sistema calpaina/calpastatina (μ-calpaina, m-calpaina e calpastatina) sia un enzima lisosomiale (catepsina) influenzano alcuni caratteri legati alla qualità della carne. In questo studio cinque SNP, testati in precedenza: CAPN530 (AF_288054.2: g.4558G> A), CAPN4751 (AF_288054.2: g.6545C T>), CAST2959 (AF_159246.1: g.2959A> G), CAST2870 (AF_159246.1: g.2870A> G), CAST282 (AY_008267: g.282G> C) e CTSD (AB_055312: g.77G> A) sono stati genotipizzati su 990 vitelloni Piemontesi. Un animal model implementato con metodi Bayesiani è stato utilizzato per valutare gli effetti dei genotipi sulle variazione di pH24, di luminosità (L *), del rosso (a *), del giallo (b *), delle perdite di cottura (CL), delle perdite di gocciolamento (DL) e della forza di taglio (SF). L'associazione con la DL è stata osservata solo per CAST282 allele G e CAPN530 allele A. L’allele A di CAPN530 ha presentato associazione anche con a * e b * e l’allele A di CAST2959 con a*. Si potrebbe ipotizzare che l'effetto ottenuto, in questo studio, sul DL sia dovuto ad una variazione nella degradazione delle proteine miofibrillari che determina l'attivazione/disattivazione dei canali causando così la perdita d’acqua (capitolo 4). Gli ultimi dieci polimorfismi, risultati variabili nelle pre-analisi, sono: GH1547 (M57764: g.1547TC> G), GHR257 (AF_140284: g.257A> G), POMC254 (J00021: g.254C T>), POU1F1 208 (EF090615: g 0,208 A> G), MC4R1069 (AF_265221: g.1069C> G), CRH240 (AF_340152: g.240G> C), DGAT10343 (AJ_318490: g.10343GC> AA), TG1696 (M35823: g.1696C T>), CPE601 (AY_970663: g.601C T>), e PRKAG3 1609 (AY_692035: g.1609G> A). Tutti questi SNP sono stati genotipizzati per calcolarne le frequenze alleliche e per testare la loro associazione con CW, PH24h, L *, a *, b *, CL, DL, e SF. Tutti gli SNPs sono risultati informativi nella popolazione Piemontese, tranne CPE601. L’Analisi statistica ha dimostrato che otto dei dieci SNPs indagati avevano effetto additivo con almeno un carattere relativo alla qualità della carcassa e delle carni bovine. Alcune di queste associazioni sono presentate per la prima volta, mentre altre hanno confermato studi già effettuati (capitolo 5).