Evaluation of the role of AIP, CDKN1B, miR-107 and AHRR in the pathogenesis of sporadic and familial pituitary adenomas

Pituitary adenomas are common benign intracranial neoplasms, with the vast majority of such tumours being sporadic. The pathogenesis of sporadic pituitary adenomas remains unclear; however, abnormal microRNAs (miRNAs) expression profiles have been recently associated with these adenomas, suggesting that miRNAs can contribute to tumour formation. In about 5% of cases, pituitary adenomas occur in a familial setting, often as part of multiple endocrine tumours syndromes, such as multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1) or Carney complex (CNC). Recently, germline mutations in the aryl hydrocarbon receptor-interacting protein (AIP) and in the CDKN1B (encoding the p27Kip1 protein) genes have been identified as causing pituitary adenoma predisposition (PAP) or associated to the development of multiple endocrine tumours, respectively. Several studies revealed AIP mutations in about 15% of kindreds with familial isolated pituitary adenomas (FIPA), a clinical entity in which pituitary tumours are the sole phenotypic manifestation among family members, while sporadic cases are only rarely mutated. Regarding CDKN1B, so far point mutations have been reported only in few subjects with clinical features of MEN1, including pituitary adenomas, but without MEN1 mutations, suggesting that they rarely cause a MEN-like phenotype in both sporadic and familial MEN1 patients. The aim of the present investigation was to study some of the tumorigenic mechanisms involved in pituitary adenoma formation both in sporadic and familial settings. Genomic DNA of a homogeneous cohort of Italian patients with either sporadic acromegaly or FIPA was analysed for point mutations and gross rearrangements in the AIP and CDKN1B genes. I detected three novel, presumably pathogenic, AIP variants in four apparently sporadic cases, and one known mutation (p.R304X) in a FIPA family. Interestingly, I found that another Italian FIPA family shares the same mutation and haplotype associated with the mutated gene, strongly supporting the presence of a founder effect. No known mutations were found in the CDKN1B gene. The analysis of miR-107, a miRNA involved in the pathogenesis of different types of tumours and predicted to downregulate AIP expression, revealed that it is overexpressed in pituitary adenomas and may act as a tumour suppressor gene. I also provided experimental evidences that AIP-3’UTR is a functional and direct target of miR-107. The study of aryl hydrocarbon receptor repressor (AHRR), a molecule which participates in one of the AIP-related pathways potentially involved in pituitary tumorigenesis, demonstrated an increased expression in GH-secreting adenomas compared to normal pituitaries. In conclusion, the main contribution of this PhD thesis was to provide new knowledge about the pathogenesis of pituitary adenomas. In particular, I found that: - mutations in the AIP and CDKN1B genes seem relatively uncommon in the Italian sporadic acromegalic patients, confirming what already reported in the literature for other populations; - a founder effect for the AIP p.R304X mutation exists in a region of central Italy; - the miRNA miR-107 interacts with AIP and may play roles in pituitary adenoma pathogenesis; - AHRR is overexpressed in somatotropinomas.

Gli adenomi ipofisari rappresentano delle comuni neoplasie intracraniche benigne, che nella maggior parte dei casi insorgono in maniera sporadica. La patogenesi degli adenomi ipofisari sporadici rimane tuttora poco chiara; recentemente, tuttavia, degli anormali livelli di espressione dei microRNA (miRNA) sono stati associati con questi adenomi, suggerendo che i miRNA possano contribuire al loro sviluppo. In circa il 5% dei casi, gli adenomi ipofisari insorgono invece in forma familiare, spesso come componenti di neoplasie endocrine multiple, quali la neoplasia endocrina multipla di tipo 1 (MEN1) o il complesso di Carney (CNC). Recentemente, mutazioni germinali nei geni aryl hydrocarbon receptor-interacting protein (AIP) e CDKN1B (codificante la proteina p27Kip1) sono state identificate, rispettivamente, come predisponenti l’insorgenza di adenomi ipofisari o associate allo sviluppo di tumori endocrini multipli. Diversi studi hanno dimostrato come mutazioni in AIP siano presenti in circa il 15% delle famiglie con adenoma ipofisario isolato (FIPA), un’entità clinica nella quale i tumori ipofisari sono l’unica manifestazione fenotipica tra i soggetti affetti, mentre siano solo raramente ritrovate nei casi sporadici. Relativamente a CDKN1B, ad oggi mutazioni puntiformi sono state descritte solo in alcuni pazienti con caratteristiche cliniche associabili al fenotipo MEN1, tra cui la presenza di adenomi ipofisari, ma privi di mutazioni nel gene MEN1. Ciò fa quindi ritenere che tali mutazioni causino solo raramente un fenotipo associabile a MEN sia nei casi sporadici che familiari. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di studiare alcuni dei meccanismi tumorigenici coinvolti nello sviluppo degli adenomi ipofisari, sia nelle loro forme sporadiche che in quelle familiari. Il DNA genomico di una coorte omogenea di pazienti acromegalici Italiani sia sporadici che familiari è stato analizzato per ricercare la presenza di mutazioni puntiformi e grossi riarrangiamenti nei geni AIP e CDKN1B. Ho individuato tre nuove varianti, presumibilmente patogeniche, nel gene AIP in quattro pazienti apparentemente sporadici, e una mutazione nota (p.R304X) sempre in AIP in una famiglia FIPA. E’ interessante notare come un’altra famiglia FIPA Italiana condivida la stessa mutazione e lo stesso aplotipo associato con il gene mutato, dimostrando quindi la presenza di un effetto fondatore. Nessuna mutazione nota nel gene CDKN1B è stata invece riscontrata nella coorte analizzata. L’analisi di miR-107, un miRNA coinvolto nella patogenesi di diversi tipi di tumore e predetto regolare negativamente l’espressione di AIP, ha rivelato come tale miRNA sia sovraespresso negli adenomi ipofisari e svolga verosimilmente un ruolo da gene oncosopressore. Ho inoltre dimostrato sperimentalemente che il 3’UTR di AIP è un reale e diretto bersaglio di miR-107. Lo studio del repressore del recettore degli idrocarburi (AHRR), una molecola coinvolta in una delle vie correlate ad AIP e potenzialmemente coinvolta nella tumorigenesi ipofisaria, ha dimostrato una sua incrementata espressione nei tumori GH-secernenti rispetto alle ipofisi normali. In conclusione, il contributo principale di questa tesi di dottorato è stato il fornire nuova conoscenza sui meccanismi patogenetici negli adenomi ipofisari. Più specificatamente, ho dimostrato che: - mutazioni nei geni AIP e CDKN1B sono relativamente rare nei pazienti acromegalici sporadici Italiani, in accordo con quanto riportato in letteratura per altre popolazioni; - esiste un effetto fondatore in una regione del centro Italia per la mutazione p.R304X del gene AIP; - il miRNA miR-107 interagisce con AIP e potrebbe avere un ruolo nella patogenesi degli adenomi ipofisari; - AHRR è sovraespresso nei somatotropinomi.