Exosomal Doxorubicin and the Treatment of Breast and Ovarian Cancers

Background The application of nanotechnology in the medical field is called nanomedicine. This novel sector have got a lot of interest from many investigators nowadays due to the important development that happened in the last decades, in particular in cancer treatment. Cancer nanomedicine has been applied in different domains such as drug delivery, nanopharmaceuticals and nanodevices. The application of nanotechnology to pharmaceutical science allowed to build up system based on at least two stage vectors (drug/nanomaterial). New formulations based on that platform show often an improvement in drug pharmacokinetics (PK), bioavailability and biodistribution owing enhanced permeability and retention (EPR) effect to passively target tumor both decreasing side effect of free drug. Among natural nanovectors, exosomes (exo) were first described in 1981 as extracellular nanovesicles with a size range of 50-200 nm. Exosomes are produced by cells embedded of cellular information and represent a formidable natural cargo for long distance communication. The name "fedexosome" denotes the general idea that exosomes could deliver cargo that conveniently manipulated could be of help for patients therapy. Aims To develop exosomes loaded with doxorubicin (DOX) To test the cytotoxic effect of exoDOX (exosomal doxorubincin) in vitro using cell lines models compared to the parental drug (DOX) To test the antitumor activity and the toxic side effects of exoDOX compared to the parental DOX in in vivo experimental models To test tissue biodistribution and pharmacokinetics (PK) of exoDOX compared to DOX in vivo experimental models To define the maximum tolerated dose (MTD) of exoDOX and DOX in in vivo experimental models Materials and Methods Purified exosomes from cell lines were loaded with DOX and characterized by nanoparticle tracking analysis (NTA), Scanning/Transmission electron microscopy (SEM/TEM) and western blot. The anti-tumoral effects of exoDOX were tested in vitro (MDA-MB-231 breast, HCT-116, LoVo and DLD1 colon and STOSE ovarian cancer cell lines) and in vivo using nude and FVB/N mice as breast and ovarian cancer models. The antitumor effect was assessed by measuring the tumor volumes. The toxic effects were evaluated by following the body weight and through histopathological analyses of mice organs. The biodistribution and PK of exoDOX and DOX were assessed by mass spectrometry (LC-MS). Results • In vitro studies showed no increased cytotoxic effect (cell viability) of exoDOX compared to DOX in all the investigated cell lines . • Similar results were observed in the in vivo models indicating no significant differences in the tumor volume after treating mice with the same concentrations of exoDOX and DOX. • In vivo toxicity analysis showed a significant reduction of cardio-toxic side effects by using exoDOX compared to free DOX. Mass spectrometry studies showed that the accumulation of exoDOX in the heart was reduced by about 40% compared to free DOX when using the same concentration of active drug. ExoDOX avoids heart toxicity by partially limiting the crossing of DOX through the myocardial endothelial cells. For this reason, mice can be treated with higher concentration of exoDOX thus increasing the efficacy of DOX as demonstrated in breast and ovarian mouse tumors. - Conclusions Differently from previously published papers that focused on the efficacy of the doxorubicin encapsulated in exosomes, in this thesis for the first time, we demonstrated that unmodified exosomes loaded with DOX are less toxic than free DOX by altering the biodistribution of the drug, these results were published in Nanomedicine (Lond) Journal in 2015. ExoDOX is safer and more effective than free DOX using breast cancer model and importantly was confirmed using the first spontaneous transformed syngeneic model of high-grade serous ovarian cancer which open the road for providing a new therapeutic opportunity, which was published recently in Nanomedicine (Lond) Jounral in 2016.

Introduzione L'applicazione delle nanotecnologie in medicina è chiamata nanomedicina. Questo settore è motivo di interesse da parte di molti ricercatori dovuto agli importanti avanzamenti avvenuti negli ultimi decenni, in particolare nel trattamento del cancro. In oncologia la nanomedicina è stata applicata in diversi settori quali la costruzione di nuovi sistemi di veicolazione del farmaco e nano dispositivi per la diagnosi. L'applicazione delle nanotecnologie alle scienze farmaceutiche ha permesso di costruire sistemi basati su almeno due vettori (farmaco/nanomateriali). Le nuove formulazioni spesso mostrano un miglioramento del profilo di farmacocinetica (PK), la biodisponibilità e biodistribuzione dimostrando una migliorata permeabilità e ritenzione passiva nel tumore (EPR effect) diminuendo gli effetti collaterali del farmaco libero. Tra i nanovettori naturali, gli esosomi (exo) sono stati descritti nel 1981 come nanovescicole extracellulari con una gamma di dimensioni da 50-200 nm. Gli esosomi sono prodotti dall invaginazione dalla conseguente gemmazione della membrana cellulare consentendo il caricamento di acidi nucleici e di componenti citoplasmatiche rappresentando formidabile mezzo naturale per la comunicazione a lunga distanza. Il nome "fedexosome" denota l'idea generale che exosomes potevano consegnare contenuti che adeguatamente ingegnerizzato potrebbe essere di aiuto per la terapia di pazienti. Scopo • Sviluppare esosomi caricati con doxorubicina (DOX) • Verificare l'effetto citotossico dell'exoDOX exosomal doxorubincin in vitro rispetto al farmaco libero (DOX), utilizzando modelli cellulari. • Testare l'attività antitumorale e la tossicità dell'exoDOX rispetto alla DOX libera in modelli sperimentali in vivo. • Valutare la biodistribuzione nei tessuti e la farmacocinetica (PK) dell'exoDOX rispetto al DOX in modelli sperimentali in vivo. • Definire la dose massima tollerata (MTD) dell' exoDOX e DOX in modelli sperimentali in vivo. Materiali e metodi Gli esosomi purificati da linee cellulari sono stati caricati con DOX e caratterizzati tramite nanoparticle tracking analysis (NTA), microscopia a scansione/ trasmissione elettronica (SEM/TEM) e western blot. Gli effetti anti-tumorali dell'exoDOX sono stati valutati in vitro in linee cellulari di tumore alla mammella (MDA-MB-231), colon (HCT-116, LoVo e DLD1) e ovaio (STOSE) e in vivo utilizzando topi nudi e FVB/N come modelli di tumore della mammella e dell'ovaio. L'effetto antitumorale è stato valutato misurando il volume del tumore. Gli effetti tossici sono stati determinati monitorando il peso corporeo e attraverso analisi istopatologiche degli organi dei topi. La biodistribuzione e la PK dell'exoDOX e DOX sono state definite mediante spettrometria di massa (LC-MS). Risultati • Studi in vitro hanno dimostrato un aumento dell'effetto citotossico (vitalità cellulare) dell'exoDOX rispetto alla DOX in tutte le linee cellulari esaminate. • Risultati simili sono stati ottenuti nei modelli in vivo e indicano differenze significative nel volume del tumore dopo aver trattato i topi con le stesse concentrazioni dell'exoDOX e DOX. • Le analisi della tossicità in vivo hanno mostrato una riduzione significativa degli effetti collaterali cardio-tossici dell'exoDOX rispetto alla DOX libera. Dalle analisi di spettrometria di massa è emerso un minore accumulo dell'exoDOX a livello del cuore di circa il 40% rispetto alla DOX libera a parità di concentrazione di farmaco attivo. • La minore tossicità cardiaca della exoDOX è dovuta ad un ridotto passaggio della DOX attraverso le cellule endoteliali del miocardio. Pertanto, come dimostrato in tumori alla mammella e all'ovaio, l'efficacia terapeutica della DOX può essere ottimizzata trattando i topi con una maggiore concentrazione dell' exoDOX. Conclusioni A differenza di quanto riportato in letteratura circa l'efficacia della doxorubicina incapsulata negli esosomi, dal nostro studio, pubblicato nel 2015 nella rivista Nanomedicine, emerge che: - la tossicità della DOX veicolata dagli esosomi è minore rispetto al farmaco libero; -la biodistribuzione della DOX veicolata dagli esosomi è diversa da quella del farmaco libero. In conclusione, lo studio effettuato dimostra che l'exoDOX è più biocompatibile ed efficace della DOX libera in modelli di tumore alla mammella. Inoltre, come da noi pubblicato di recente sulla rivista Nanomedicine, tale risultato è stato confermato con studi su un modello singenico di carcinoma ovarico sieroso, aprendo così la strada ad un nuovo approccio terapeutico per il cancro all'ovaio.