Cyclic nucleotide signalling interplay in rat neonatal cardiac myocytes: FRET-based targeted biosensors reveal compartment-specific modulation of cAMP levels by cGMP

In the heart, the second messengers cAMP and cGMP mediate the effects of several hormones and neurotransmitters, regulating cardiac function and are the target of key drugs used to treat heart conditions. In vitro, cGMP modulates the activity of the cAMP-degrading phospodiesterases (PDEs) PDE2 and PDE3. In particular, cGMP allosterically activates PDE2 whereas it acts as a competitive inhibitor for PDE3. Therefore, cGMP can potentially influence intracellular cAMP levels. However, the impact of cGMP signals on cAMP signalling in intact living cardiac myocytes is still largely unexplored. We investigated whether in rat neonatal cardiomyocytes cGMP can alter intracellular cAMP signals via modulation of PDEs activity and whether this modulation is different in distinct subcellular compartments. We focused on the locales in which the two isoforms of the cAMP effector Protein Kinase A (PKA), PKAI and PKAII, reside. To detect localized levels of cyclic nucleotides in these compartments we used targeted cAMP and cGMP sensors. Such sensors exploit the phenomenon of Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) for the detection of cyclic nucleotides changes in intact living cells. Real time imaging of cardiomyocytes expressing these sensors indicates that cGMP generated by the soluble (sGC) or the particulate guanylyl cyclase (pGC) has a different impact on cAMP levels in the two compartments and differently affects the response to the beta-adrenoreceptor agonist isoproterenol in these locales. cGMP generated by the nitric oxide-sGC pathway causes an inversion of the cAMP gradients in the two compartments in response to isoproterenol. This modulation is compartment specific and involves cGMP-mediated activation of PDE2 in the PKAII-compartment and cGMP-mediated inhibition of PDE3 in the PKAI-compartment. The effect of cGMP on cAMP levels results in a different activation of PKA isoforms and affects the phosphorylation of downstream PKA targets. In contrast, activation of the pGC by atrial natriuretic peptides affects cAMP levels solely in the PKAII-compartment where cGMP blunts the cAMP response to β-AR stimulation selectively via activation of PDE2. These findings demonstrate a complex interplay between cAMP and cGMP signalling in cardiac myocytes resulting in a different functional outcome depending on the specific subcellular compartment where this interplay takes place.

Nel cuore, i secondi messaggeri cAMP e cGMP mediano gli effetti di diversi ormoni e neurotrasmettitori e regolano la la forza e la frequenza cardiaca. cAMP e cGMP, inoltre, costituiscono bersagli chiave nel trattamento di diverse patologie cardiache. In vitro, cGMP modula l'attivita' enzimatica delle fosfodiesterasi 2 e 3 (PDE2 e PDE3), enzimi responsabili della degradazione di cAMP. In particolare, cGMP attiva la PDE2 agendo su siti allosterici di legame denominati domini GAF, e inibisce la PDE3 agendo da inibitore competitivo. cGMP puó quindi agire come modulatore dei livelli intracellulari di cAMP. Nel presente lavoro di tesi ė stato investigato, in colture primarie di cardiomiociti di ratto, come cGMP, agendo su PDE2 e PDE3, influenza le vie di segnale mediate da cAMP a livello di singoli compartimenti subcellulari. In particolare ci siamo focalizzati nei compartimenti che ospitano le due isoforme di PKA (PKAI e PKAII). Le variazioni intracellulari di cAMP e cGMP sono state monitorate usando biosensori fluorescenti basati sul FRET indirizzati in questi due compartimenti. Esperimenti di real time imaging in cardiomiociti hanno evidenziato che il cGMP generato dalla forma solubile o particolata di guanilato ciclasi ha effetti diversi sulla risposta beta-adrenergica. L'attivazione della forma particolata di guanilato ciclasi ad opera di donatori di ossido nitrico porta ad una inversione dei gradienti di cAMP nei due compartimenti in risposta ad isoproterenolo. Questa effetto é dovuto alla modulazione compartimento-specifica delle PDE che prevede l’attivazione di PDE2 nel compartimento che ospita PKAII e l’inibizione di PDE3 nel compartimento che ospita PKAI. La modulazione dei livelli di cAMP da parte di cGMP si traduce in una differente attivazione delle due isoforme di PKA e in una alterazione della fosforilazione di bersagli di PKA. Al contrario, l’attivazione della guanilato ciclasi particolata modifica i livelli di cAMP solo nel compartimento PKAII dove il cGMP, attivando la PDE2, attenua la generazione di cAMP in risposta a isoproterenolo. Questi risultati evidenziano un complesso interplay tra le vie di segnale mediate da cAMP e cGMP che si risolve in effetti diversi a seconda del compartimento subcellulare interessato.